Раздавленная капля - препарат в микробиологии. Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ) Раздавленная капля микробиология

Метод раздавленной капли

Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.

Каплю микробной суспензии помещают на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. При работе с культурой, выросшей на твердой среде, на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, затем стерильной пипеткой берут небольшое количество культуры и перемешивают ее в капле. Покрывное стекло помещают ребром на предметное и осторожно помещают его на суспензию, следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги.

Определение липолитической активности

Липолитические свойства культуры исследуют на среде определённого состава (бульон Штерна). Готовят бульон следующим образом: к 100 см 3 МПБ добавляют 1 см 3 глицерина и приливают 2см 3 свежеприготовленного 10 %-ного водного раствора сульфита натрия, затем по каплям 10 %-й спиртовой раствор основного фуксина (? 5 кап.).

Культуры культивируют в термостате при 37 0 С. Отмечают изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие хлопков.

Приготовление бактериальной суспензии

Стерильную жидкую синтетическую среду разливают в стерилизованные конические колбы по 100 см 3 .

Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, делают посев на скошенный агар.

Подготовленные таким образом культуры инкубируют в термостате 24 ч при температуре (375)С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводят 5 см 3 соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносят в колбы, содержащие по 100 см 3 соответствующей жидкой синтетической среды.

Культивирование микроорганизмов проводят в термостате при температуре 385С, с переменным механическим воздействием, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки.

Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ)

Сущность метода заключается в определении в 1 см 3 воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при культивировании на синтетической питательной среде при температуре 40 С в течении 24 часов. Определение начинают с приготовления разведений. Для этого в несколько пробирок наливают 10 см 3 стерильной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см 3 исследуемой воды. Новой стерильной пипеткой вносят пробу в пробирку со стерильной водой, после чего этой же пипеткой набирают 1 см 3 из приготовленного разведения и переносят во вторую, из второй в третью и т. д. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. По истечении 24 часов при температуре 40 С подсчитывают число выросших колоний. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. Результаты подсчета выражают в количестве бактерий на 1 см 3 анализируемой воды с учетом посеянного объема.

Микроскопические одноклеточные организмы, называемые «микробы», а также некоторые бактерии, например, колиформные (формой напоминающие палочки) в огромном количестве содержатся в воде, особенно если она из природных источников - заросший и илистый пруд, ручей, лужа, речные заводи. Рассмотрим, как приготовить препарат «раздавленная капля», данный опыт считается простым и подходит в качестве начального обучения ребенка или начинающего биолога азам микроскопирования.

Препаратом называется подготовленная специальным образом для детального исследования на микроскопе биологическая ткань, микроорганизмы, субстрат. Изучение осуществляется на клеточном уровне, при этом функционирование органов или органоидов может быть остановлено действиями исследователя с применением фиксаторов. Неотъемлемой составной частью микропрепарата являются предметные и покровные стекла, между которыми он заключается для придания биоткани максимального плоского состояния, повышающего эффективность фокусировки на большом увеличении. Склеиваются стеклянные поверхности при помощи капли воды или бесцветной прозрачной пихтовой смолы. Пузырьки воздуха удаляются, края склейки протираются промокашкой. Если микропрепарат приготовлен для временного использования, стеклышки подлежат тщательной промывке, а отработанный образец уничтожению.

Последовательность, необходимая для приготовления препарата раздавленная капля , а также используемые инструменты:

Регистрация результатов наблюдения может происходить глазами или путем фотографирования. Для этого понадобится цифровая камера-окуляр, вставляющаяся вместо обычного в окулярную трубку и подключающаяся к компьютеру через последовательный порт USB. В этом случае картинка будет транслироваться на мониторе, пользователю будут доступны функции измерения размеров и углов, графическая обработка и фотосъемка.

Микромир, невидимый невооруженным зрением, способен впечатлить взрослых и детей, проявляющих интерес к науке. Микроскопия для многих становится не только элементом общеобразовательного процесса, но и увлекательным хобби. На что еще можно посмотреть в микроскоп, как делать микропрепараты с насекомыми, клетками лука, тонкими растительными срезами - вы можете прочитать в познавательных статьях и обзорах в тематическом блоге (раздел «Интересно»). Свои вопросы рекомендуем присылать в обратной связи или по электронной почте.

Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.

Культуры для приготовления препарата.

Материалы для исследования и техника взятия

Вопросы для рассмотрения

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под редакцией Егорова Н.С. МГУ, М. 1995г. Стр. 81-97, 20-28.

2. Коротяев А.И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец. литература». Санкт-Петербург, 1998. Стр. 14-18.

3. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М. 1972. Стр. 5-23.

ТЕМА: Приготовление микроскопических препаратов и их окраска.

1. Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.

2. Приготовление мазков и их фиксация.

3. Красители, используемые в микробиологии.

4. Простые и сложные методы окраски.

Задание для выполнения лабораторной работы

1. Приготовить фиксированный препарат из молодой культуры дрожжей, окрасить его в течение 2-3 мин метиленовым синим и микроскопировать без иммерсии.

2. Приготовить фиксированный препарат из почвенной суспензии, окрасить по методу Грама, микроскопировать его и зарисовать.

3. Выполнить схематическое изображение клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных прокариот.

Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей, обоженной в пламени спиртовки или стерильной пипеткой.

Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель в правую. Правой рукой вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают в пламени спиртовки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и ватную пробирку и закрывают пробирку. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени спиртовки.

Для исследования живых клеток микроорганизмов применяют методы «раздавленной и висячей капли». В обоих случаях возможно окрашивание объекта “прижизненными” красителями – “витальная” окраска.

На чистое предметное стекло наносят каплю воды. В каплю вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла, но если суспензия попала за край - удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также просмотра крупных объектов - плесневых грибов, дрожжей. Применяют при изучении запасных веществ клетки. Метод “висячей” капли – используются для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь её дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают иммерсионный объектив.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю раствора метиленового синего или нейтрального красного в концентрациях от 0,001 до 0,00001%. Затем готовят препарат по одному из выше указанных методов и микроскопируют. После микроскопии препараты, «раздавленной» или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Методика приготовления препарата:

· на середину предметного стекла наносят каплю бульонной культуры вульгарного протея. Каплю осторожно покрывают покровным стеклом, не допуская образования между стеклами пузырьков воздуха;

· препарат микроскопируют сухой системой, с использованием объектива х40. Оптика микроскопа должна быть очень чисто протерта, конденсор слегка опущен, а его диафрагма прикрыта с целью затемнения поля зрения.

· протей является перитрихом, передвигается в поле зрения беспорядочно. Важно не спутать характер его движения с пассивным перемещением в результате броуновского движения - беспорядочного колебания клеток.

4. Изучение подвижности протея (Proteus vulgaris) в препарате «висячая капля» с использованием фазово-контрастной микроскопии (демонстрация). Препарат висячей капли готовят, нанося в центр покровного стекла каплю исследуемого материала. Предметное стекло с лункой, края которой смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. После этого препарат переворачивают покровным стеклом вверх; капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. При микроскопии сначала используют объектив «малого» увеличения (х8) для нахождения края капли, после чего определяют подвижность бактерий с помощью объектива «большого» увеличения (х40) или иммерсионной микроскопии.

5. Морфология боррелий – возбудителей возвратного тифа (Borrelia recurrentis). Мазок из крови больного возвратным тифом (демонстрация). Окраска по Романовскому - Гимза. Краситель состоит из смеси азура-2 (продукт окисления метиленового синего) и эозина. Среди эритроцитов заметны тонкие лиловые удлиненные спирохеты, образующие до 9 крупных неравномерных завитков.

6. Морфология возбудителя сифилиса (Treponema pallidum). Окраска по Бурри (тушевой препарат). На темном фоне видны бесцветные трепонемы с 8 - 12 равномерными завитками.

7. Морфология и подвижность лептоспир - Leptospira interrogans. Темнопольная микроскопия (демонстрация). Представители этого рода имеют тонкие частые неглубокие завитки и обладают своеобразным движением, во время которого концы вращаются под углом к основной части тела. В стадии покоя имеют форму крючка. В темнопольном микроскопе используются специальные конденсоры (параболоид-конденсор с затемнением в центре и внутренней зеркальной поверхностью для отражения лучей света, либо кардиоид-конденсор, в котором лучи света отражаются сначала от выпуклой поверхности, а затем от вогнутой). Темнопольные конденсоры создают эффект бокового освещения, в результате чего на темном фоне видны светящиеся микроорганизмы. Морфология спирохет представлена на рис. 20.

8. Морфология риккетсий – возбудителей эпидемического сыпного тифа (Rickettsia provazeki).Окраска по Здродовскому. Методика окраски:

· Окраска мазка фуксином Циля в течение 5 минут.

· Промывание водой.

· Обработка мазка 0,01% раствором хлористоводородной кислоты.

· Промывание водой.

· Окраска метиленовым синим в течение 1 минуты.

· Промывание водой, высушивание, микроскопия. Риккетсии, окрашенные по этому методу, выглядят в виде мелких полиморфных микроорганизмов рубиново-красного цвета.

9. Хламидии (Chlamidia trachomatis) в мазках из уретры больных урогенитальным хламидиозом (внутри - и внеклеточное расположение). Демонстрационный препарат, окраска по Романовскому-Гимза.

10. Актиномицеты в материале от больного актиномикозом (окраска по Романовскому-Гимза). Зарисовать типичные для этого заболевания друзы актиномицетов, отметить лучистую структуру актиномицетов.

Тема 4. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. АСЕПТИКА, АНТИСЕПТИКА, ДЕЗИНФЕКЦИЯ, СТЕРИЛИЗАЦИЯ. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МЕТОДЫ И ЭТАПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ - метод приготовления препаратов для микроскопического исследования биологических объектов. В исследовательской практике Р. к. используют при изучении формы, размера и расположения микроорганизмов, выявления подвижности бактерий, при наблюдении за ростом и размножением микроорганизмов, для изучения реакций микроорганизмов на хим. соединения (хемотаксис) и физические факторы. В практике мед. микробиологии этот метод применяют при микроскопическом исследовании материала от больных для обнаружения возбудителей заболеваний, обладающих специфической морфологией,- простейших, спирохет, грибков. Методом Р. к. и его модификациями пользуются также при микроскопическом исследовании кала и других выделений на яйца и личинки гельминтов.

Для приготовления препарата готовят взвесь исследуемого материала в изотоническом р-ре хлорида натрия или водопроводной воде, добавляя вещества, облегчающие процесс микроскопии (красители, осветлители и др.); используют также культуры микроорганизмов на жидких или полужидких питательных средах, биол, жидкости. Каплю материала помещают на предметное стекло и сверху кладут покровное стекло, избегая появления в препарате пузырьков воздуха. Жидкость не должна выступать за пределы покровного стекла. Щель между предметным и покровным стеклами может быть герметизирована вазелином или смесью, состоящей из равных объемов вазелина и парафина. При исследовании быстродвижущихся микроорганизмов, чтобы уменьшить скорость их движения к суспензии можно добавить метилцеллюлозу. В этом случае можно наблюдать движения жгутиков. При микроскопии живых клеток возможно использование прижизненных (витальных) красителей - метиленового синего, нейтрального красного и других (в разведении 1:1000 - 1:10 000), повышающих контрастность препаратов и позволяющих выявить внутреннее строение простейших, грибков и др.

В зависимости от объекта и целей изучения микроскопию можно проводить при малом или большом увеличении с сухой или иммерсионной системами. В простейшем случае микроскопию осуществляют в затемненном поле зрения при суженной диафрагме и опущенном конденсоре. Более четкое изображение дают микроскопия в темном поле зрения, фазово-контрастная или аноптральная микроскопия (см. Микроскопические методы исследования). При приготовлении препаратов толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, а толщина покровных стекол - 0,17 мм. Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и обезжиренными. При микроскопии в темном поле зрения препарат готовят как можно тоньше, а толщина покровных стекол не должна превышать 0,11 мм.

С. С. Белокрысенко.