Б. Подробная технология изготовления сыворотки крупного рогатого скота на бойнах г
Vetlek_Item Object ( => vetlek_cps_availability_alarms => vetlek_cps_customers => vetlek_cps_properties_to_groups => vetlek_cps_items => vetlek_cps__seq_items => vetlek_cps_images => vetlek_cps_images_to_items => vetlek_cps__seq_images => vetlek_cps_properties => vetlek_cps_properties_to_items => vetlek_cps_items_to_groups => /var/www/www-root/data/www/vetlek.ru/img/shop/items/ => /img/shop/items/ => 5129 => Сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, фл. 100 мл => =>
СОСТАВ И ФОРМА ВЫПУСКА
Сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота — биопрепарат, полученный из крови волов, гипериммунизированных инактивированными штаммами возбудителей сальмонеллеза, эшерихиоза и пастереллеза, авирулентными штаммами вирусов парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита. По внешнему виду представляет собой жидкость светло-желтого цвета с красноватым оттенком, при хранении образуется незначительный осадок, который легко разбивается при встряхивании флакона. Расфасовывают сыворотку по 100 мл в стеклянных флаконах из темного стекла, герметично укупоренных полимерными крышками и обкатанных алюминиевыми колпачками.
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Гипериммунная сыворотка способствует формированию пассивного иммунитета к возбудителям сальмонеллеза, пастереллеза, кишечной палочки, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 у крупного рогатого скота, напряженность которого составляет 10 дней. Для формирования напряженного активного иммунитета у животных к инфекциям применяются вакцины. Механизм действия сыворотки основан на связывании и нейтрализации патогенных антигенов специфическими антителами биопрепарата. Гипериммунная сыворотка эффективна для лечения указанных выше заболеваний, особенно на ранних стадиях инфекционного процесса и хорошо сочетается с препаратами, применяемыми для симптоматического лечения (противомикробные препараты и пробиотики).
ПОКАЗАНИЯ
Назначают крупному рогатому скоту в целях специфической профилактики и лечения сальмонеллеза, пастереллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита.
ДОЗЫ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Перед введением сыворотки необходимо простерилизовать шприцы и иглы. Для каждого животного используют отдельную стерильную иглу. Перед использованием флакон необходимо энергично встряхнуть, а место укола обработать 70% этиловым спиртом. Перед введением флакон следует подогреть на водяной бане до температуры 36-38 ºС. С профилактической целью сыворотку вводят животным подкожно двукратно с интервалом 7-10 дней: телятам по 20-30 мл, взрослому поголовью по 30-60 мл. С лечебной целью сыворотку вводят внутримышечно или внутривенно в начальной стадии инфекционного заболевания: телятам по 40-60 мл, взрослому поголовью по 60-120 мл. Отсутствие лечебного эффекта уже после инъекции свидетельствует о другой этиологии заболевания и для уточнения диагноза следует провести дополнительные лабораторные исследования.
ПОБОЧНЫЕ ДЕЙСТВИЯ
В очень редких случаях при повышенной индивидуальной чувствительности у животных возможны аллергические реакции.
ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ
При применении сыворотки противопоказания не выявлены.
Уже произвели забор крови у 1000 животных, сыворотку разлили в бутылки и бесплатно раздали почти 20000 детей. Таким образом показано, что промышленное изготовление сыворотки на бойне с соблюдением правил асептики и санитарных предписаний возможно.
Серотерапевтическое предприятие не дает дополнительных гарантий - оно не обладает правом производить вскрытие животного-донора.
Технология, применяемая в нашем производстве, может показаться менее строгой с точки зрения асептики, чем классический метод. Но у нее большое преимущество в скорости, так как сыворотка полностью изготавливается в день забора крови.
Если нынешние обстоятельства побудили нас производить сыворотку на бойне, ясно, что это временная мера, так как гематоген и лечебные сыворотки могут быть изготовлены только в условиях специализированного института.
Отбор животных . В Лионе доктор Гье, главный ветеринар бойни, и доктор Фонтенай, ветеринар-инспектор, сами отбирают доноров среди скота, предназначенного для обеспечения нашего города мясом. Отобранному животному ставят клеймо на правом плече, чтобы облегчить дальнейший контроль. После забоя тщательно проверяются органы животных. Известно, что вскрытие является самым верным методом обнаружения туберкулеза.
Последующие операции покажут, что сыворотка больного животного никогда не потреблялась.
Забор крови у животных . В помещении для забора крови бык-донор надежно удерживается автоматическим ярмом.
Ветеринар дезинфицирует кожу йодом на уровне шеи животного и делает скальпелем надрез в области яремной вены. Венозная пункция производится троакаром, стерилизованным длительным кипячением. Как только появляется кровь, к троакару присоединяется стерилизованный в автоклаве резиновый шланг, чтобы связать его напрямую и асептично с дефибринатором.
Ниже описаны технология дефибринирования и способ стерилизации дефибринатора.
От каждого животного получают 8-10 литров крови, которую взвешивают на весах, находящихся под аппаратом. Для облегчения операции санитарного контроля на каждом дефибринаторе имеется ярлык с данными животного-донора.
Надо отметить, что забор крови производится асептично благодаря замкнутой цепи всех составных частей: троакар, резиновый шланг и дефибринатор, которые предварительно стерилизуются.
Ярлык с датой забора крови сопровождает полученную кровь с момента венозной пункции до ее превращения в сыворотку и хранения в холодильниках.
Дефибринирование крови . В большинстве серотерапевтических заведений кровь, разлитая в стеклянные сосуды, отделяет сыворотку под давлением груза. В этих условиях кровь, впервые полученная от крупного рогатого скота, содержит мало сыворотки (примерно 10%). Поэтому серотерапевтический центр в Лионе использует специальную технологию, дающую 50% сыворотки, и к тому же в более короткий срок.
Доктор Мерье смог разработать этот метод отчасти после выводов, сделанных им в Королевском институте в Роттердаме и в Серотерапевтическом институте в Милане.
Как только в этих институтах получают кровь, ее дефибринируют в стерильных аппаратах, напоминающих маслобойки. В течение 5 минут кровь сбивается в сосуде, защищенном от воздуха. Надо точно соблюдать время дефибринирования: при его недостатке может произойти свертывание, а при избытке - гемолиз (из-за разрыва эритроцитов). Надо пользоваться лабораторными часами, позволяющими отметить точно 15 минут дефибринирования.
В верхней части рис. 4 видно, что количество заборов крови достигло 1000, что записывается на эмблеме Центра.
Центрифугирование . Сразу после дефибринирования аппараты переносятся в лабораторию, находящуюся в нескольких метрах от помещения для забора крови. Содержимое каждого дефибринатора обрабатывается отдельно, чтобы можно было изъять сыворотку животного, оказавшегося больным.
Несвертываемая после дефибринирования кровь пропускается через сепаратор "Альфа-Лаваль" (молочный сепаратор, приспособленный нами для изготовления сыворотки). Под действием центробежной силы кровь делится на равные части: красная содержит красные шарики, а прозрачная составляет сыворотку (фибрин остается на лопастях дефибринатора).
От одного животного получают 8-10 литров крови или примерно 4-5 литров сыворотки, которую сливают во флакон Пирекса, простерилизованный при 180°С. К флакону прилагается ярлык дефибринатора, и под тем же номером заполняется карточка для обеспечения санитарного контроля.
В сыворотку добавляют специальный антисептик, рассчитанный так, чтобы он был достаточно активным, не нарушая прозрачности и вкуса сыворотки. На 1 литр сыворотки добавляют также 100 мл раствора, содержащего 1:1000 формалина и 1:5000 сюнуксола. (Между приготовлениями центрифуга тщательно дезинфицируется антисептиком.)
В принципе красную фракцию крови следовало бы возвращать мясникам для изготовления кровяной колбасы, но чаще всего она остается неиспользованной, поэтому из нее можно готовить сироп по нижеописанной технологии.
Особые случаи приготовления сиропа из крови . Сироп отличается двумя преимуществами: дает возможность использовать красную часть крови, остающуюся после получения сыворотки, и обладает приятным вкусом, который нравится детям.
Из-за нехватки глицерина трудно приготовить сироп для длительного хранения, но можно сделать очень активный продукт на воде и давать его детям по 2-3 столовых ложки в день. К красной части крови добавляют 20% питьевой воды и хранят сироп в ледниках, пока осуществляется санитарный контроль. Затем добавляют равную часть 100-процентного сахарного сиропа (сахар можно получить по карточкам коллективов, которым сироп предназначен).
В сироп добавляют лимонный или апельсиновый экстракт, чтобы нейтрализовать вкус крови, и разливают в бутылки по 250 мл.
Тиндаллизация сыворотки . Сразу после центрифугирования, то есть менее чем через час после забора крови, сыворотку типдаллизируют при температуре 56°С в течение часа. Для этого ее опускают в водяную баню с автоматически поддерживаемой температурой. Тиндаллизация при такой температуре (при более высокой сыворотка свертывается) необходима для частичной стерилизации сыворотки, хотя быстрота ее приготовления сама по себе является гарантией асептики.
Следует отметить, что каждый пятилитровый сосуд снабжен первоначальным ярлыком дефибринатора, таким образом, нумерация сыворотки соответствует нумерации животных-доноров.
Контрольная картотека . Карточка позволяет в любое время проверить происхождение животного-донора, этапы приготовления сыворотки, дату розлива, а также распределение сыворотки.
Санитарный контроль . Пока сосуды складированы в холодильное камере, ветеринары-инспекторы занимаются санитарным контролем животных-доноров. После их забоя проводится тщательное вскрытие, позволяющее выявить малейшие симптомы туберкулеза. В случае обнаружения болезни можно легко изъять соответствующую сыворотку. Известно, что кровь каждого животного перерабатывается отдельно и сыворотка содержится в отдельных, пронумерованных флаконах.
Серотерапевтический центр Общественного комитета гигиены детства на Лионскнх бойнях
Контрольный номер...
Бычья сыворотка в литрах
Приведенная выше карточка и ярлык предотвращают любую путаницу.
В Лионе санитарные меры особенно строги, так как один и теже ветеринары отбирают животных, проводят забор крови и проверяют мясо.
Стерилизация оборудования . Животные сыворотки являются прекрасной средой для размножения микробов, и их можно стерилизовать лишь частично. При температуре выше 56° они свертываются и мутнеют, если добавить сильный антисептик. Поэтому при всех операциях изготовления сыворотки необходима максимальная стерильность, оборудование перед употреблением должно быть обеспложено.
Индивидуальные дефибринаторы стерилизуются следующим образам: на ночь, предшествующую забору крови, их заполняют антисептическим раствором, а за несколько часов до забора крови освобождают от антисептика при помощи крана, находящегося в нижней масти аппарата. Центрифуги, применяемые для изготовления сыворотки, также обрабатывают антисептиком, в том числе между переработкой содержимого каждого дефибринатора.
В электропечи при температуре 180°С стерилизуется вся стеклянная посуда, включая пятилитровые сосуды для хранения сыворотки.
Флаконы емкостью в 250 мл для сыворотки также стерилизуются при температуре 180°С. Для упрощения операции посуда находится в ящиках, которые используются при розливе и при раздаче населению.
Для культуральных и бактериологических работ в лабораторных условиях большое значение имеют сыворотки крови, которые необходимы как для приготовления питательных сред для культур клеток млекопитающих, так и в качестве составной части микробиологических питательных сред .
Широкое применение находит сыворотка крови крупного рогатого скота , поскольку сырье для нее достаточно доступно в любом количестве. Однако не менее востребована и лошадиная сыворотка, а также сыворотки крови других животных.
Качественная сыворотка КРС!
В процессе производства высококачественной сыворотки крови следует уделять большое внимание разделению крови и последующей стерилизации сыворотки. Только с использованием самых современных фильтрационных установок возможно максимальное качество. Однако, для сохранения качества сыворотки важно использовать и стерильную тару. Для герметизации стеклянные стерилизованные емкости различного объема (куда и фасуется сыворотка крс и других животных) закупориваются резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками.
Затем каждой партии присваивается номер, который дублируется в паспорте продукта и на его этикетке. Однако сыворотки крови доходят до клиента не сразу, перед попаданием на рынок они проходят тщательнейшие проверки на качество, и только после их прохождения получают сертификаты качества и допуск к реализации.
Лошадиная сыворотка , равно как и сыворотка крови крс , может храниться в течение одного года при темпеатуре от 2 до 8 градусов Цельсия выше нуля. В замороженном же состоянии срок годности сыворотки увеличивается до 2х лет.
У нас всегда есть в наличии сыворотка крови крупного рогатого скота и другие сыворотки крови для использования в лабораторной практике. Вся наша продукция (сыворотки крс, лошадиные, эмбриональная (Fetal bovine serum или FBS) имеет сертификаты качества и регистрационные удостоверения. Мы работаем с лучшими российскими и зарубежными изготовителями сывороток.
|
Артикул |
Наименование |
Стоимость |
Фасовка |
|
РК001 |
Сыворотка крови крупного рогатого скота нативная неспецифическая без консерванта. Подходит также для бактериологических работ. Производитель (Россия). Хранить при -20°С. |
264,00 руб. |
200 мл/фл |
| 405,00 руб. | 400 мл/фл | ||
| РК005 |
Сыворотка крови крупного рогатого скота жидкая для культур клеток. Производитель PAA Laboratories. Хранить при -20°С. |
208,62 руб. | 50 мл/фл |
| 395,00 руб. | 100 мл/фл | ||
| 1 673,84 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК008 | Сыворотка крови лошади, без консерванта. Производитель PAA Laboratories. Хранить при -20°С. | 230,00 руб. | 50 мл/фл |
| 410,00 руб. | 100 мл/фл | ||
| 1 917,00 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК011 | Сыворотка крови новорожденных телят. Производитель PAA Laboratories. Хранить при -20°С. | 253,00 руб. | 50 мл/фл |
| 495,00 руб. | 100 мл/фл | ||
| 1 764,00 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК014 | Сыворотка крови эмбриональная телячья. Производитель HyClone. Хранить при -20°С. | 526,00 руб. | 50 мл/фл |
| 1 025,00 руб. | 100 мл/фл | ||
| 4 786,00 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК017 |
Сыворотка крови эмбриональная телячья характеризованная. Производитель HyClone. Хранить при -20°С.
|
16 937,60 руб. | 500 мл/фл |
| РК018 | Сыворотка крови эмбриональная телячья стандартизованная. Производитель HyClone. Хранить при -20°С. | 2 208,00 руб. | 50 мл/фл |
| 4 200,00 руб. | 100 мл/фл | ||
| 16 771,00 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК021 | Сыворотка крови эмбриональная телячья отборная. Производитель PAA Laboratories. Хранить при -20°С. | 510,00 руб. | 50 мл/фл |
| 995,00 руб. | 100 мл/фл | ||
| 4 411,00 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК024 | Сыворотка крови эмбриональная телячья стандартная. Производитель PAA Laboratories. Хранить при -20°С. | 510,00 руб. | 50 мл/фл |
| 995,00 руб. | 100 мл/фл | ||
| 4 411,00 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК027 | Сыворотка крови эмбриональная телячья для гибридом. Производитель PAA Laboratories. Хранить при -20°С. | 4 814,00 руб. | 500 мл/фл |
| РК030 |
Сыворотка крови эмбриональная телячья для стволовых клеток. Производитель PAA Laboratories. Хранить при -20°С.
|
867,00 руб. | 50 мл/фл |
| 8 297,00 руб. | 500 мл/фл | ||
| РК032 | Сыворотка крови лошади нормальная для бактериологических работ с консервантом, тестирована на отсутствие микоплазм. Производство (Россия). Хранить от 2 до 8°С. | 310,00 руб. | 100 мл/фл |
Уважаемые посетители нашего сайта!
Представленная на данном сайте информация, касающаяся стоимостных характеристик продукции, носит информационный характер и ни при каких условиях не является публичной офертой. Для получения актуальной информации, пожалуйста, обращайтесь к
ИНСТРУКЦИЯ
по применению сыворотки крови крупного рогатого скота
нативной неспецифической
(организация – производитель: ООО «Торговый дом «БиАгро», г. Владимир)
I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
1. Сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) нативная неспецифическая без консерванта.
2. Сыворотка крови крупного рогатого скота нативная неспецифическая без консерванта состоит из сыворотки крови КРС нативной.
3. По внешнему виду сыворотка представляет собой прозрачную жидкость соломенно-жёлтого цвета, допускается слегка красноватый оттенок, при хранении возможна опалесценция и незначительный осадок, разбивающийся при встряхивании.
4. Сыворотка выпускается во флаконах: 200, 400, 450 см3. Флаконы укупоривают резиновыми пробками, укрепляют алюминиевыми колпачками.
На каждый флакон наклеивают этикетку с указанием: организации-производителя, её адреса и товарного знака, названия сыворотки, количества (см3), номера серии, даты изготовления (месяц, год), срока годности (месяц, год), номера госрегистрации, надписи «Для животных», информации о подтверждении соответствия, условий хранения, обозначения СТО.
Флаконы обёртывают обёрточной бумагой и помещают в коробки из картона. В каждую коробку вкладывают Инструкцию по применению. На коробку наклеивают этикетку, на которой указывают: организацию-производителя, её адрес и товарный знак, название сыворотки, обозначение настоящего СТО, номера серии, дату изготовления (месяц, год), срок годности (месяц, год), номер госрегистрации, условия хранения, информацию о подтверждении соответствия, количество флаконов в коробке, надпись «Для животных».
5. Сыворотку крови КРС хранят в закрытом сухом месте в коробках или транспортной таре при температуре от 2?С до 10?С в течение одного года. Допускается хранение при температуре минус 20?С в течение одного года.
6. После вскрытия герметично укупоренные флаконы хранят при температуре от 2?С до 10?С в течение одного года. Допускается хранение при температуре минус 20?С в течение одного года.
7. При нарушении целостности флаконов, наличии посторонней примеси, не разбивающихся при встряхивании хлопьев, изменении цвета, нарушении укупорки и маркировки сыворотка подлежит утилизации путём кипячения или автоклавирования при 0,11 Мпа в течение 15 мин.
8. Сыворотка с истекшим сроком годности не требует специальных средств для утилизации.
II. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
9. Сыворотка крови КРС стимулирует рост перевиваемых, первичных, гибридных, бактериальных, грибных, микоплазменных культур клеток, а также репродукцию вирусов.
III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
10. Сыворотку КРС применяют как ростостимулирующую добавку к питательным средам, используемым для выращивания культур клеток, бактерий, микоплазм, грибов, репродукцию вирусов.
Владельцы патента RU 2460786:
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения сыворотки крови включает два этапа. На первом этапе получают нативную сыворотку крови взрослого крупного рогатого скота. При этом взятие крови проводят асептически только из сердца бычков в поликарбонатные бутыли, в которые предварительно наливают 5%-ный раствор натрия хлористого в объеме 100-200 мл. Бутыли наполняют кровью примерно наполовину их объема и переносят в холодильную камеру с температурой +1-+2°С, укладывают их под углом 35° на 72 часа. Затем проводят отсос сыворотки и предварительную очистку - фильтрами EKS при температуре +2-+6°С. После чего заполняют сывороткой полиэтиленовые канистры и выдерживают их при температуре -(15-20)°С не менее недельного срока. Второй этап состоит в том, что из нативной сыворотки крови бычков удаляют ингибирующие рост клеток вещества методом однократного замораживания и оттаивания. Проводят сбор верхних светлых слоев сыворотки, начиная сверху до границы раздела их с гемолизированными слоями, и осуществляют предварительную очистку через глубинные фильтры EKS. Затем проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры при температуре +2-+6°С. Способ позволяет получить сыворотку, пригодную для культивирования клеток животных и человека, в том числе гибридом, увеличить выход сыворотки к объему взятой крови, улучшить ее качество. 6 табл., 5 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании линии клеток животных, человека, а также гибридом.
В известных литературных источниках технология получения данной сыворотки крови описывается весьма поверхностно (Методы культуры клеток для биохимиков / Р.А.Адамс: Пер. с англ. - М.: Мир. - 1983. - 264 с.; Животная клетка в культуре / Под ред. проф. Л.П.Дьяконова. - М.: Изд-во «Спутник +». - 2009. - 656 с.), а источник в Интернете (http:wwwleitran.ru/page.php?al=sivorotka) вообще не несет никакой информации о ее производстве.
Известен способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, который мы взяли в качестве близкого аналога: путем взятия крови у животных из сердца или яремной вены, отстоя, сбора и стерилизующей фильтрации конечного продукта, описанный в справочнике под редакцией Б.И.Антонова (Лабораторные исследования в ветеринарии: Справочник / Б.И.Антонов, В.Борисова, П.М.Волкова и др., под ред. Б.И.Антонова. - М.: Агропромиздат. - 1986. - 352 с.). Но в данном аналоге имеют место существенные недостатки:
1. Кровь берут, как у коров, так и бычков (общеизвестно, что сыворотка крови животных существенно отличается от их половой принадлежности);
2. Взятие крови проводят двумя методами: из сердца без соблюдения асептики и из яремной вены с соблюдением асептики, но продолжительность заполнения 10-литровых бутылей до 5-литровой отметки составляет 6-10 минут и более;
3. Кровью заполняют только стеклянные бутыли, которые часто бьются и являются потенциальным источником травматизма сотрудников, работающих с ними, кроме того, они дорогостоящие;
4. Отстой сыворотки проводят в холодильной камере 24-48 часов при температуре +6-+10°С, а при такой высокой температуре идет быстрое размножение вульгарной микрофлоры, ведущей к снижению качества конечной продукции;
5. Выход сыворотки незначителен (20-25% от объема взятой крови) по причине использования физиологического раствора NaCl для смачивания стенок бутылей и взятия крови из яремной вены;
6. Собранную сыворотку подогревают до +30-+37°С, для предварительной очистки через глубинные фильтры EKS, а затем стерилизущей фильтрации через мембранные миллипоровые фильтры. Принимая во внимание, что фильтрация сыворотки - продолжительный процесс, то при высокой температуре идет быстрое накопление в ней микрофлоры, что негативно отражается на ее качестве;
7. По причине выпадения белков и для более надежной стерилизации рекомендуют 2-3-кратную фильтрацию сыворотки, что увеличивает время приготовления конечного продукта и затраты на расходные материалы;
8. Сыворотка, получаемая по данной технологии, не соответствует по ряду физико-химических параметров и непригодна для культивирования клеток животного происхождения.
Другим аналогом, но только по качественным характеристикам, мы видим фетальную сыворотку крови плодов коров, которая до сих пор считается самой лучшей биологической добавкой в питательные среды для выращивания культур клеток животных и человека (ТУ ФС 42-7ВС-85), утвержденным Минздравом СССР 4 апреля 1985 года.
Для четкого представления цели изобретения в табл.1 приведены концентрации ингибиторов роста клеток и других качественных показателей в естественной сыворотке крови взрослого крупного рогатого скота по ТУ 49.24 б-82 и в нативной сыворотке крови плодов коров по ТУ ФС 42-7ВС-85, утвержденным Минздравом СССР 4 апреля 1985 года.
| Таблица 1 | ||
| Показатель | Сыворотка крови взрослого крупного рогатого скота по ТУ 49.24 б-82 | Сыворотка крови эмбрионов коров по ТУ ФС 42-7ВС-85 |
| Прозрачность (535 нм) | Не более 0,450 ед. оптической плотности | Не более 0,300 ед. оптической плотности |
| РН | 7,0-7,8 | 7,6±0,2 |
| Свободный гемоглобин | Не более 60 мг/дл | Не более 50 мг/дл |
| Общие липиды | 40-200 мг/дл | 30-50 мг/дл |
| Холестерин | 90-170 мг/дл | 10-20 мг/дл |
| Общий белок, в том числе: | 6,3-7,7 г/дл | 4,5±2,5 г/дл |
| альбумины | 55±5% | |
| α-глобулины | 35±5% | |
| β-глобулины | 10±5% | |
| γ-глобулины | Ниже 1% | |
| Ростстимулирующая активность на перевиваемых линиях клеток по индексу пролиферации | Не менее 4,0-5,0 | Не менее 6,0-7,0 |
Наиболее близким по техническому решению является способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, который описан в патенте РФ №1813783 «Способ получения сыворотки крови животных для культивирования клеток животных тканей» от 5 марта 1994 года, который взят нами в качестве прототипа предлагаемого изобретения.
Технологический процесс по данному патенту включает заморозку нативных сывороток крови животных при -(15-20)°С в течение 24-48 часов с последующим оттаиванием их при комнатной температуре, сбор светлых слоев сыворотки, начиная сверху, до границы раздела их с гемолизированными фракциями, стерилизующую фильтрацию и контроль качества полученных препаратов.
Задачей предлагаемого изобретения является существенное увеличение выхода сыворотки к объему взятой крови, улучшение ее качества, а также получение сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, пригодной для культивирования клеток животных и человека, в том числе гибридом, за счет удаления из нативной сыворотки крови бычков отдельных ингибиторов роста клеток.
Поставленная задача решается нами тем, что в способе получения сыворотки крови от взрослого крупного рогатого скота проведены существенные, прямо противоположные существующим литературным источникам, изменения в технологии ее получения.
В отличие от данного изобретения, в предлагаемом нами проекте, процент удаляемых при размораживании сыворотки крови бычков компонентов снижается до 5-10%, кроме того, сыворотка крови предварительно фильтруется при +2-+6°С через фильтры EKS, а затем - через стерилизующие мембранные фильтры любой надежной фирмы, например: «Millipore Intertec» США, ее филиала в Ирландии, или «Владисарт» Россия. Данный способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота для культивирования клеток животного происхождения включает два этапа:
1-й этап заключается в кардинальном изменении получения нативной сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота, что является весьма существенным моментом в изменении технологического процесса: взятие крови проводят только у бычков и только из сердца асептически специальными системами в стеклянные или поликарбонатные бутыли емкостью 10-20 литров, в которые предварительно налит 5%-ный раствор натрия хлористого в объеме 100-200 мл. Бутыли наполняют кровью, примерно наполовину их объема, оставляют стоять в вертикальном положении на 2-3 часа в убойном цехе, а затем переносят в холодильную камеру с температурой +1-+2°С и укладывают их под углом 35° на 72 часа, после чего специальной системой проводят сбор отстоявшейся сыворотки (выход ее к объему взятой крови превышает 40%), ее предварительную очистку фильтрами EKS при температуре +2-+6°С, которой заполняют полиэтиленовые канистры емкостью 20 литров и выдерживают их при температуре -(15-20)°С не менее недельного срока.
2-й этап состоит в удалении из нативной сыворотки крови бычков ингибирующих рост клеток веществ (остаточного гемоглобина, общих липидов, γ-глобулинов и др.) методом замораживания-оттаивания, сбора верхних светлых слоев сыворотки, начиная сверху, до границы ее с гемолизированными фракциями, предварительной очистке через глубинные фильтры EKS, а затем стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с расфасовкой ее по 400-450 мл во флаконы емкостью 500 мл, контроле стерильности и биологической активности.
Существенным отличием способа получения сыворотки крови крупного рогатого скота является то, что мы используем прямопротивоположную существующим методикам технологию ее получения, обоснование которой дано ниже на ряде примеров.
Пример 1. Взятие крови у бычков и отделение сыворотки.
Забор крови у бычков, с целью получения сыворотки, проводили с соблюдением асептики двумя асептическими методами: из яремной вены и сердца в 10-литровые стеклянные или 20-литровые поликарбонатные бутыли, в которые наливают по 100-200 мл 5%-ного раствора натрия хлористого.
Нами установлено, что время заполнения 10-литровых бутылей до 5-литровой отметки при взятии крови из сердца бычков составляло 1-2 минуты, а при взятии из яремной вены - 8-10 минут.
После взятия крови в бутыли их оставляли стоять в вертикальном положении при комнатной температуре 2 часа, а затем помещали в холодильную камеру на стеллажи под углом 35° на 72 часа при температуре +1-+2°С. Расположение бутылей с кровью под углом 35° способствует лучшей ретракции сгустков, а температура отстоя сыворотки +1-+2°С препятствует размножению случайно попавшей в кровь микрофлоры.
Пример 2. Сравнительное изучение отделения сыворотки бычков в зависимости от места взятия крови и процентного содержания натрия хлористого в растворе.
Результаты данного опыта приведены в таблице 2. В опыте три варианта. В каждом варианте по 20 бутылей с объемом крови от 4,65 до 5,10 литра. В варианте 1 кровь брали из яремной вены в 10-литровые бутыли, в которых находилось по 100 мл 1%-ного раствора NaCl. В варианте 2 кровь брали из сердца в бутыли с 1%-ным раствором NaCl по 100 мл, а в варианте 3 кровь брали также из сердца, но в бутыли был налит 5%-ный раствор NaCl по 100 мл.
Как следует из таблицы 2, выход сыворотки из крови, взятой из сердца бычков в бутыли с 1%-ным раствором NaCl достоверно выше, чем из крови, взятой из яремной вены. Использование же гипертонического 5%-ного раствора NaCl, наливаемого в бутыли для смачивания их стенок, способствует еще большему выходу сыворотки из крови, взятой из сердца бычков. Высокий выход сыворотки по предлагаемому способу имеет место и в производственных условиях. Так, например, в 30 бутылей было взято 150 литров крови, а после отстоя отсосано 63 литра сыворотки или 42% от объема крови.
Пример 3. Качественные показатели сыворотки крови бычков и коров.
Изучение сыворотки крови бычков и коров проведено по следующим качественным показателям: оптическая плотность, содержание общего белка и остаточного гемоглобина, ростстимулирующая активность на перевиваемых культурах клеток. У бычков массой тела 300-400 кг и коров - 400-450 кг кровь брали из сердца в 10-литровые бутыли, содержащие по 100 мл 5%-ного раствора NaCl, до 5-литровой отметки сыворотку отстаивали 72 часа в холодильной камере при температуре +1-+2°С, после чего отбирали пробы сыворотки, которые замораживали, оттаивали и стерилизовали через мембранные фильтры.
Прозрачность (оптическая плотность), общий белок и остаточный гемоглобин сыворотки крови отдельных животных устанавливали непосредственно после взятия проб сыворотки, а также после центрифугирования ее при 1500 об/мин в течение 10 минут. Общий белок определяли по биуретовой реакции, а остаточный гемоглобин - гемиглобинцианидным методом после центрифугирования сыворотки. Ростстимулирующую активность сыворотки крови оценивали на культурах клеток SPEV и MDBK по индексу пролиферации после 72-часового роста при плотности посева 40000 кл./см 2 и по кратности увеличения клеточной популяции после 5-суточного роста при плотности посева 20000 кл./см 2 . Клетки культивировали во флаконах Карреля с посевной площадью 8 см 2 в среде Игла MEM с глутамином, канамицином и 10%-ной сыворотки крови.
Кровь взяли у 40 бычков и 40 коров. Результаты данных опытов приведены в таблице 3. Через 72-часового отстоя оптическая плотность сыворотки крови коров превышала таковую бычков более чем в 2 раза. Почти такое же соотношение отмечено и по вариабельности данного показателя. После центрифугирования оптическая плотность сыворотки крови коров снижалась, хотя и оставалась несколько выше, чем у бычков. В сыворотке крови коров регистрировали более высокие концентрации общего белка и остаточного гемоглобина по сравнению с этими показателями сыворотки крови бычков. Коэффициент вариации по остаточному гемоглобину сыворотки крови коров превышал 54%. Высокие оптическая плотность и концентрация остаточного гемоглобина сыворотки крови коров, по-видимому, связаны с меньшей резистентностью к разрушению у них эритроцитов. Ростстимулирующая активность сыворотки крови коров (по индексу пролиферации и кратности увеличения клеточной популяции) на культурах клеток SPEV и MDBK уступает биологической активности таковой, полученной из крови бычков.
| Таблица 3 | ||
| Показатель | Сыворотка крови | |
| бычков М±м |
коров М±м |
|
| Прозрачность, ед. оптической плотности, после: | ||
| сбора сыворотки: | 0,258±0,015 | 0,538±0,035 |
| коэффициент вариации, % | 22,02 | 38,07 |
| достоверность | Р<0,001 | |
| центрифугирования сыворотки: | 0,152±0,006 | 0,201±0,009 |
| коэффициент вариации, % | 20,30 | 22,52 |
| достоверность | Р<0,001 | |
| Общий белок, г/дл: | 7,04±0,12 | 7,62±0,17 |
| коэффициент вариации, % | 6,30 | 9,24 |
| достоверность | Р<0,001 | |
| Остаточный гемоглобин, мг/дл: | 54,1±3,2 | 101,2±10,8 |
| коэффициент вариации, % | 27,25 | 54,03 |
| достоверность | Р<0,001 | |
| Ростстимулирующая активность сыворотки крови на культурах клеток по: | ||
| индексу пролиферации, | 6,40-6,96 | 5,85-6,47 |
| кратности увеличения клеточной популяции | 10,3-11,2 | 9,5-10,2 |
Пример 4. Преимущество взятия крови из сердца бычков для получения сыворотки, предназначенной для культивирования клеток.
Цель исследования - выявить особенности биохимического состава сывороток, полученных из крови, взятой из яремной вены, сонной артерии и сердца бычков, а также оценить их ростовые свойства на перевиваемых культурах клеток. Для получения сыворотки у 18 бычков массой тела 300-400 кг асептически брали по 300 мл крови из яремной вены, сонной артерии и сердца во флаконы емкостью 500 мл с 5 мл 5%-ного раствора NaCl (из расчета 2 флакона на животное) и помещали их под углом 35° в холодильную камеру с температурой +2°С на 48 часов. Отстоявшуюся сыворотку из каждой пары флаконов собирали отдельно, центрифугировали и замораживали при -15°С, предварительно взяв пробы для проведения физико-биохимических исследований. Перед стерилизующей фильтрацией через мембранные фильтры, получаемые сыворотки крови из сердца, сонной артерии и яремной вены, смешивали отдельно по 200 мл.
Определение рН и оптической плотности, контроль на стерильность, а также оценку ростстимулирующих свойств сыворотки крови осуществляли общепринятыми методами. Общий белок определяли по биуретовой реакции, остаточный гемоглобин - гемиглобинцианидным методом, холестерин - с реактивами фирмы «Konelab» (Финляндия), кроме того, контролировали низкомолекулярные азотистые вещества (креатинин, мочевина и мочевая кислота), пигменты (прямой и общий билирубин), ферменты (ЛДГ, КФК, глутаминтрансфераза, амилаза, АсАТ, щелочная фосфатаза, АлАТ), неорганические вещества (кальций, железо, фосфор), глюкозу с использованием реактивов фирмы «Rendox» на приборе Daytona Rendox (Великобритания) и проводили электрофорез сывороточных белков на ацетатцелюлозных фильтрах Владисарт тип - ФМАЦ-0,45-(80·100)-11106 с размерами пор 0,45 мкм. Цифровой материал подвергали компьютерной статической обработке с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (м), среднеквадратического отклонения (σ), коэффициента вариации (C V) и достоверности различий (Р) результатов с использованием программы Microsoft Excel. Результаты перечисленных исследований сывороток крови бычков приведены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||||
| Показатели | Сердце | Артерия | Вена | |||||
| М±м | C V, % | М±м | C V, % | Р | М±м | C V, % | Р | |
| рН | 7,6±0,02 | 0,8 | 7,71±0,02 | 0,68 | ≤0,01 | 7,56±0,02 | 0,58 | ≤0,05 |
| Прозрачность, ед. опт. пл. | 0,267±0,01 | 4,9 | 0,279±0,01 | 4,16 | ≤0,01 | 0,310±0,01 | 5,52 | ≤0,01 |
| Неорганические вещества: | ||||||||
| фосфор, мМ/л | 1,64±0,09 | 15,4 | 1,40±0,11 | 22,39 | ≤0,01 | 1,63±0,14 | 23,51 | >0,05 Н.Д |
| кальций, мМ/л | 2,01±0,06 | 9,0 | 1,82±0,07 | 9,97 | ≤0,05 | 1,99±0,07 | 9,53 | >0,05 Н.Д |
| железо, мкМ/л | 9,60±0,53 | 15,6 | 9,75±0,43 | 12,37 | Н.Д. | 10,91±0,52 | 13,5 | ≤0,05 |
| Остаточный гемоглобин, мг/дл | 54,8±1,4 | 7,2 | 61,2±2,07 | 9,57 | ≤0,05 | 70,4±1,80 | 7,21 | ≤0,05 |
| Общие липиды, г/л в том числе: |
1,98±0,08 | 10,8 | 2,26±0,09 | 10,29 | ≤0,01 | 1,84±0,07 | 10,47 | ≤0,01 |
| холестерин, мМ/л | 2,64±0,24 | 25,6 | 2,97±0,25 | 23,49 | ≤0,01 | 3,18±0,26 | 23,54 | ≤0,05 |
| триглицериды, мМ/л | 0,34±0,03 | 23,2 | 0,40±0,03 | 21,10 | ≤0,05 | 0,47±0,04 | 22,75 | ≤0,05 |
| Общий белок, г/л в том числе белковые фракции, % |
73,4±2,85 | 10,9 | 82,3±3,07 | 10,54 | ≤0,05 | 79,99±2,91 | 9,48 | ≤0,05 |
| Альбумины | 44,47±1,12 | 7,1 | 42,99±1,19 | 7,85 | ≤0,01 | 42,40±1,11 | 7,41 | ≤0,05 |
| глобулины: | ||||||||
| α- | 8,63±0,18 | 5,8 | 9,40±0,22 | 6,69 | ≤0,01 | 9,04±0,29 | 8,93 | ≤0,05 |
| β- | 10,56±0,22 | 5,8 | 10,51±0,34 | 8,39 | ≤0,05 | 10,22±0,16 | 4,42 | ≤0,05 |
| γ- | 36,4±1,12 | 8,9 | 37,1±1,23 | 9,66 | ≤0,05 | 38,30±1,21 | 8,89 | ≤0,05 |
| Ферменты, Ед/л: | ||||||||
| ЛДГ | 2191±119 | 15,4 | 2250±47 | 10,63 | ≤0,01 | 1918±261 | 38,52 | ≤0,05 |
| КФК | 170±6 | 9,2 | 179±12 | 19,03 | ≤0,05 | 169±11 | 17,89 | >0,05 Н.Д. |
| глутамин-трансфераза | 21,02±1,1 | 15,5 | 21,80±1,46 | 18,96 | ≤0,05 | 22,17±1,31 | 16,72 | ≤0,05 |
| амилаза | 17,58±1,4 | 23,0 | 19,87±1,26 | 17,15 | ≤0,05 | 21,58±1,15 | 15,10 | ≤0,05 |
| АсАТ | 91,88±6,69 | 20,6 | 103,90±9,13 | 24,86 | ≤0,05 | 99,13±7,06 | 20,15 | ≤0,01 |
| щелочная фосфатаза | 96,92±10,06 | 29,4 | 98,53±9,15 | 26,27 | ≤0,01 | 106,91±10,4 | 27,53 | ≤0,01 |
| АлАТ | 34,66±1,97 | 16,1 | 39,73±1,93 | 13,75 | ≤0,05 | 36,67±1,86 | 14,35 | ≤0,01 |
| Билирубин, мкМ/л: | ||||||||
| прямой | 0,63±0,07 | 33,2 | 0,55±0,07 | 38,24 | ≤0,05 | 0,48±0,09 | 53,0 | ≤0,01 |
| общий | 3,42±0,29 | 24,2 | 3,71±0,17 | 13,13 | ≤0,01 | 3,19±0,27 | 24,16 | ≤0,05 |
| Глюкоза, мМ/л | 27,58±1,41 | 14,4 | 11,28±0,91 | 22,73 | ≤0,01 | 12,38±1,06 | 24,32 | ≤0,01 |
| Низкомолекулярные азотистые вещества: | ||||||||
| креатинин, мкМ/л | 138,11±8,66 | 17,7 | 150,79±8,3 | 15,56 | ≤0,01 | 161,71±6,5 | 11,36 | ≤0,05 |
| мочевина, Ед/л | 4,78±0,25 | 14,5 | 4,56±0,24 | 14,93 | ≤0,01 | 4,95±0,23 | 13,05 | ≤0,01 |
| мочевая кислота, М/л | 220,0±14,8 | 9,1 | 170,0±16,9 | 28,18 | ≤0,05 | 156,0±10,5 | 18,96 | ≤0,05 |
Для оценки ростстимулирующих свойств сывороток крови бычков в качестве клеточных моделей использовали перевиваемые почечные линии SPEV (эмбриона свиньи) и MDBK (эмбриона коровы). Стерильные сыворотки крови из яремной вены, сонной артерии и сердца бычков добавляли в 10%-ной концентрации в среду Игла MEM с глутамином и канамицином. Для вычисления индекса пролиферации (ИП) клеточную взвесь рассевали по 2 мл с посевной площадью 3 см 2 при плотности посева 42000 кл./см 2 . После 72-часового роста подсчитывали количество клеток в образовавшемся монослое. Проведено по 8 опытов с каждой культурой, в опытах количество клеток подсчитывали в камере Горяева по 4 раза. Результаты пролиферативной активности клеток SPEV и MDBK на средах сыворотками крови бычков из разных участков кровеносной системы приведены в таблице 5.
Пролиферация культур клеток, выращенных на средах с сыворотками, полученными из крови, взятой из сонной артерии, яремной вены, была ниже, чем у клеток, выращенных на среде с сывороткой крови из сердца, что, несомненно, связано с их различным биохимическим составом.
Пример 5. Удаление из нативной сыворотки крови бычков веществ, ингибирующих рост клеток, методом замораживания - оттаивания. Отдельные образцы сыворотки имеют различный биохимический состав, зависящий от ряда факторов: кормления и содержания животных, сезона года, породы, пола и др. Замораживание и оттаивание позволяют получать сыворотку крови для культур клеток с прогнозируемым биохимическим составом.
Из всего разнообразия получения сыворотки методом замораживания - оттаивания нами отдано предпочтение варианту, включающему: одну заморозку нативных сывороток крови бычков при -(15-20)°С в течение не менее 7 суток с последующим оттаиванием их при +20-+40°С, сбор светлых слоев сывороток, начиная сверху, до границы раздела их с гемолизированными слоями, предварительную, а затем стерилизующую фильтрацию и контроль качества полученных препаратов.
Основные физико-химические показатели сыворотки крови бычьей в сравнении с нативной сывороткой ниже, а именно: концентрация белка - в 1,19-1,94; свободного гемоглобина - в 1,32-2,94; общих липидов - в 1,56-2,64, в том числе общего холестерина - в 1,37-2,53 раза.
Согласно результатам электрофореза сывороточных белков в полиакриламидном геле, в сыворотках крови, получаемых методом замораживания - оттаивания, в сравнении с нативными сыворотками крови возрастает относительная концентрация альбуминов и снижается концентрация γ-глобулинов, тогда как концентрация α- и β-глобулинов остается практически без изменения.
Показатели состава сыворотки крови бычьей, получаемой методом замораживания - оттаивания, представлены в таблице 6.