Иммунодиагностика

Иммунодиагностика - это определение возбудителя, его иммунологически активных дериватов или синтезированных в ответ на их внедрение факторов иммунного ответа организма, с помощью специфических иммунодиагностических препаратов.

Иммунодиагностические препараты, называемые просто диагностическими, бывают нескольких типов: антигенные, иммуноглобулиновые и антительные.

Антигенные диагностикумы - это диагностические препараты на основе микробов, либо вирусов, токсинов, грибов и пр. (микробо-вирусо-токсинные препараты), предназначенные для определения антител в прямых иммунологических реакциях либо антигена в непрямых.

Антительные диагностикумы - это диагностические препараты на основе глобулинов иммунных сывороток или антител, предназначенные для обнаружения антигена в прямых иммунологических реакциях или антител в непрямых.

Иммуноглобулиновые диагностикумы - это препараты на основе иммуноглобулинов нормальных сывороток, основанные на эффекторных свойствах молекулы ИГ. У ИГ на Fc- фрагменте есть рецепторы для связывания некоторых агентов, например, С3 компонента системы комплемента, белка А золотистого стафилококка, Т- и В- лимфоцитов, макрофагов и антител к иммуноглобулинам и пр. Эта связь осуществляется не по типу антиген-антитело, но бывает необходимым определять С-реактивный белок, проводить быструю индикацию стафилококка по белку А и пр. Для этих целей готовят иммуноглобулиновый диагностикум.

К настоящему времени разработано достаточно много как иммунореагентов, так и иммунологических реакций (более 200), требующих определенной систематизации.

Предлагаем нашу классификацию иммунологических реакций в сокращенном виде. При классификации иммунологических реакций необходимо уточнить: протекают они in vivo (в организме) или вне организма, в эксперименте (in vitro). Кроме того, иммунологические реакции должны быть поделены на клеточные - с участием лимфоцитов и гуморальные - с участием антител. Поэтому краткая (общая) схема иммунологических реакций может быть проиллюстрирована следующим образом:

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

протекающие in vivo . воспроизводимые in vitro

(реакции иммунитета) (иммунодиагностические)

гуморальные клеточные серологические клеточные

В данном разделе нас интересуют серологические реакции, воспроизводимые in vitro. Полная схема иммунологических реакций представлена в монографии В.А. Шамардина и др. (1989). Иммунологические реакции делятся нами по основному признаку: протекающие по типу антиген-антитело или по эффекторному типу. В данном разделе нас интересуют те реакции, которые протекают по типу антиген-антитело. Их следует различать по феномену, визуализирующему взаимодействие иммунореагентов (например, феномен агглютинации и пр.).

Реакции, основанные на определенном феномене, целесообразно делить на большие группы, имеющие общность характера взаимодействия (прямые, непрямые, осадочные, диффузионные и пр.) Такая схема отражена в таблице № 15 .

Таблица № 15.

Иммунодиагностические реакции, воспроизводимые in vitro

Феномены иммунодиагностических реакций
Агглютинации	Потребления комплемента	Иммунофлюо-ресценции	Преципитации	Нейтрализации	Иммуноконъю- гации
группы иммунодиагностических реакций
а. прямые б. непрямые в.торможения г. сорбции	б. непрямые в. торможения	б.непрямые в.торможения	а. осадочные б. диффузионные	а. гашения действия б.нейтрализа-ции	а. прямые б.непрямые в. торможение

Иммунологические феномены

Феномен агглютинации. Феномен основан на взаимодействии антител и антигенов с образованием характерного осадка (агглютината). При этом не менее, чем один из реагентов должен находиться в клеточной форме или быть в форме клеточного диагностикума.

К прямому методу следует относить все варианты взаимодействия клеток с антителами (агглютинация бактерий, эритроцитов, клеток тканей человека и пр.). К прямому методу относят разновидности РА микробов, агглютинации тромбоцитов, гемагглютинации и пр.

К непрямому методу относят все варианты взаимодействия антигена и антител, когда один из них находится в форме диагностикума (латексного, эритроцитарного, ализаринового, бентонитового, угольного и пр.). Непрямой метод составляют двухкомпонентные реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), варианты Ко-агглютинации, определение антигена в сорбированном виде (РОСА) и пр.

К методу торможения относят сложные многокомпонентные реакции, первым этапом которых является нейтрализация предполагаемого в исследуемом материале растворимого агента антисывороткой (либо антител исследуемой сыворотки - антигеном), вторым этапом - визуализация этого взаимодействия путем введения в смесь гомологичных диагностикумов (антительных, во втором случае – антигенных либо взвесь бактериального диагностикума). Результатом многоэтапных взаимодействий будет агглютинат. К методу торможения относят реакции: задержка прямой агглютинации и гемагглютинации (соответственно, РЗА, РТГА), варианты торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), подавления гемагглютинации непрямой (РПНГ), определения класса агглютинирующих антител (РОКА) и др.

К методу определения специфически сорбированного агента относятся сложные и многокомпонентные реакции, первым этапом которых является специфическое связывание антигена антительным диагностикумом (либо антител - антигенным диагностикумом), а вторым этапом - агглютинация комплекса антителами, во втором случае антигеном. К методу относятся реакции: непрямой метод Кумбса, определения гаптена (РОГ), угнетение непрямой гемагглютинации (РУНГА), реакция расклеивания эритроцитов (РРЭ).

Феномен потребления комплемента. Феномен основан на взаимодействии антител и антигена в присутствии комплемента

К прямому методу относят разновидности лизиса клеток при непосредственной реакции их с антителами в присутствии комплемента (бактериолиз, гемолиз, тромбоцитолиз и пр.).

К непрямому методу относят варианты лизиса нативных эритроцитов, нагруженных антигеном, за счет взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Непрямой метод представлен реакциями: непрямого бактериолиза (бактерии нагружены вирусом) и непрямого гемолиза (эритроциты нагружены антигеном).

К методу с индикаторной системой относят большую группу многокомпонентных, двух- или многосистемных реакций, основанных на лизисе индикаторных клеток. В качестве этих индикаторных клеток обычно используют гемолитическую систему (нативные эритроциты барана, нагруженные гемолитической сывороткой). Первым этапом является взаимодействие растворимых антигена и антител (один из компонентов находится в исследуемом материале) в присутствии комплемента. Второй этап - внесение индикаторной системы, по состоянию которой (лизис эритроцитов или нет) судят о наличии в исследуемом материале антител (или антигена). Метод составляют реакции: Борде-Жангу, потребления комплемента (РПК), варианты связывания комплемента (РСК) - в жидкой фазе и на плотной среде (в геле).

К методу торможения относят также группу реакций, на первом этапе которых проходит адсорбция комплемента комплексом антиген-антитело, что регистрируется на втором этапе, путем внесения клеточного антигена (торможение прямого метода) или диагностикума на нативных эритроцитах (торможение непрямого метода) либо гемсистемы на нативных эритроцитах барана. К методу относятся: реакция нейтрализации лизиса микроба (РНЛМ), торможения непрямого гемолиза (РТНГем), подавление связывания комплемента (РПСК).

Феномен иммунофлюоресценции. Феномен основан на взаимодействии клеток, адсорбированных на предметном стекле, с иммунными сыворотками, предварительно меченными флюоресцирующим красителем. Это приводит к характерному свечению комплекса при просмотре в люминисцентном микроскопе.

К прямому методу относят варианты непосредственного взаимодействия клеток (ткани, микробы и пр.) с мечеными антителами, например, реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФП), реакции иммунофлюоресценции в притертом препарате (РИФПП) и пр.

К непрямому методу относят варианты выявления взаимодействия комплекса антиген -антитело с помощью дополнительно внесенного меченого антительного диагностикума. К методу относятся реакции: целлюлозно-флюоресцирующих антител (РЦФА), иммунофлюоресценции непрямой (РИФН), иммунофлюоресценции с использованием бумажных дисков (РИФБД), иммунофлюоресценции комплемента (РИФК).

К торможению иммунофлюоресценции относят многокомпонентные реакции, которые основаны на конкуренции за взаимодействие с гомологичным антигеном меченых антител и антител исследуемой сыворотки - реакция тушения иммунофлюоресценции (РИФТ).

Феномен преципитации. Основан на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в жидкой фазе или в геле. Это приводит к образованию мелкодисперсного агрегата (преципитата).

К методам образования преципитата в жидкой фазе относятся реакции: пробирочная Крауса, кольцепреципитации Асколи, капилярной преципитации, флокуляции и различные осадочные реакции (Кана, Закс-Витебского и пр.).

Метод, основанный на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в геле, по принципу диффузии компонентов, составляют реакции: простая одномерная и двумерная диффузия, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и его модификации.

Феномен нейтрализации. Основан на регистрации реакции антител с патогенными агентами (микробами, вирусами и пр.) или с их токсинами. Это приводит к нейтрализации возбудителя или его болезнетворного действия на организм.

Метод иммобилизации представлен реакциями: иммобилизации трепонем, иммунного прилипания, иммобилизации холерного вибриона, ингибиции метаболизма микробов.

Метод гашения болезнетворного действия составляют: нейтрализация инфекционного действия (на животных, куриных эмбрионах и культурах тканей) с учетом результатов их взаимодействия по летальности, бляшкообразованию, гемагглютинации, гемолитическим свойствам токсина, некротическом действии токсина и пр.

Феномен иммуноконъюгации. Основан на взаимодействия растворимых антигенов и антител на твердой фазе. Обнаружение комплекса проводят по определению метки.

По природе метки феномен составляют несколько семейств: радиоиммунный (РИА), иммуноферментный (ИФА), иммуномагнитный (ИМА), иммуноспектральный (ИСА) и др.

К семейству радиоиммунных реакций относятся: варианты радиоиммунного анализа (РИА), иммунорадиометрического анализа (ИРМА), радиосорбционные тесты (РИСТ и РАСТ), твердый сэндвич-радиоиммунный тест (ТСРИТ) и др.

К семейству иммуноферментных реакций относятся: метод ферментативного усиления (МФУ), иммуносорбентный метод со связанным ферментом (ЕLISА), варианты сэндвич-иммуноферментного анализа (ТСИФА) и пр.

В свою очередь эти большие группы реакций следует дополнительно делить на прямые, непрямые и торможения (конкурентные пробы).

Разновидности иммунологических реакций

В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов).

Феномен агглютинации

Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).

Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо:

1. Растворитель- 0,85 % раствор хлорида натрия.

2. Известную 2 % бактериальную взвесь.

3. Исследуемую сыворотку.

Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.

Исследуемая культура.

Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле.

1. Развернутый вариант РА.

В настоящее время реакция не применяется.

2. Капельный вариант РА .

Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.

Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле.

Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов.

Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат.

При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными.

Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать.

Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.

Диагностикумы

иммуноглобулиновые антительные антигенные

белковые небелковые

Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций.

1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Для постановки реакции необходимо иметь:

1. Диагностический препарат.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.

3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.

4. Инактиватор для исследуемых сывороток.

Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.

Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах: в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант).

Макровариант.

Постановка реакции осуществляется в 2 этапа.

1 этап . Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. Из первой лунки 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.

2 этап . Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу № 17).

Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0,05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.

Таблица № 17.

Схема постановки развернутого варианта РНГА

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, в мл
Исследуемая сыворотка, 1:50
Растворитель
Полученные разведения
АЭД, 5 % взвесь
Результат РНГА
Титр РНГА	Титром РНГА является разведение сыворотки 1:3200

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Результаты РНГА учитывают по следующей схеме:

1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".

2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки.

3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки.

4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат.

Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка.

С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо.

Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД.

Реакция Ко-агглютинации (РКоА).

Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно.

Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин.

К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0,1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум.

На предметное стекло наносят две капли: первая капля - этоиспытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле.

Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана.

РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации.

Реакция не применяется.

РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы: РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный).

Метод выполняют в 4 этапа.

1 этап . Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА.

2 этап . Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель.

3 этап . Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

Таблица № 18.

Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, мл
Известная сыворотка 1:100
Растворитель
Полученные разведения
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА
Титр РНГА и рабочая доза антисыворотки	Титром антисыворотки является разведение 1:1600, а рабочая доза – (1:1600): 3 = 1:533 .

Иммунологические реакции используются для выявления специфических антител, идентификации возбудителей и других антигенов, определения групп крови и подбора адекватного донора при пересадках органов и тканей.

Серологические реакции - реакции между антигенами и антителами in vitro - применяют для выявления неизвестного антигена или антитела с помощью известного антитела или антигена соответственно. Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, растворимые - преципитации. В лабораторной практике используют реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

Антигены, по которым отдельные индивидуумы или группы особей одного вида различаются между собой, являются изоантигенами. Изоантигены, генетически связанные, объединены в группы, получившие названия: система АВО, резус и др.

В плазме человека всегда содержатся естественные, полные, холодовые изоантитела к агглютиногенам А и В. Агглютинин анти-А - a-агглютинин, а агглютинин анти-В - b -агглютинин.

Определение группы крови (определение агглютиногенов).
Реакцией агглютинации с помощью стандартных сывороток определяют групповые агглютиногены в эритроцитах. Ампулы или флаконы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива, имеющих по 3 гнезда, или в 1 штатив с двумя рядами гнезд. Слева направо ставят сыворотки групп 0 α-b (I), А b (II), В α (III). Отдельно ставят сыворотку АВ0 (IV). Определение производят на белых пластинах или тарелках. На левой стороне делают надписи 0 α-b , в середине - А b , справа - В α. Под соответствующей надписью наносят по 0,1 мл каждой стандартной сыворотки отдельной для каждой сыворотки пипеткой. Кровь для исследования берут из пальца, 0,01 мл крови сухой стеклянной палочкой наносят рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Перемешивают капли стандартной сыворотки с исследуемой кровью. После этого пластину покачивают, затем на 1-2 мин оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее 5 мин, несмотря на то что агглютинация начинается в течение первых 10-30 сек., так как возможна поздняя агглютинация, например эритроцитами группы А2 (II).
По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 мин, в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки в течение 5 мин, после чего оценивают результат. При положительной реакции в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные зернышки (агглютинанты), состоящие из склеенных эритроцитов. При этом сыворотка полностью или частично обесцвечивается. В случае отрицательной реакции на протяжении всего времени наблюдения (5 мин) жидкость остается равномерно окрашенной в красный цвет, и в ней не обнаруживаются агглютинаты. Результаты реакции в каплях с сыворотками одной группы обеих серий должны быть одинаковыми. Возможны различные комбинации реакций:

1) сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию - испытуемая кровь принадлежит к группе 0 (I);

2) сыворотки групп 0 α-b (I) и В α (III) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А b (II) - отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе А (II);

3) сыворотки группы 0 α-b (I) и А Я (II) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В α (III) - отрицательную: испытуемая кровь принадлежит к группе В (III);

4) сыворотки всех групп дали положительную реакцию.
В этом случае для исключения неспецифической агглютинации проводят дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ0 (IV).

Отсутствие агглютинации в капле этой сыворотки при наличии ее во всех остальных позволяет отнести кровь к группе АВ0 (IV). Наличие агглютинации с сывороткой группы АВ0 (IV) говорит о неспецифической агглютинации. В этих случаях нужно исследование повторить с отмытыми эритроцитами.

Определение полной групповой формулы крови (агглютиногенов и агглютининов). Одновременное определение групповых антигенов эритроцитов и агглютиногенов сыворотки позволяет установить полную групповую формулу исследуемой крови. Для этого берут 2 различные серии стандартных сывороток групп крови 0 α-b (I), А b (II), В α (III), АВ0 (IV); 0,85%-ный раствор хлорида натрия; стандартные эритроциты групп 0 (I), А (II), В (III). В центрифужную пробирку, содержащую 0,25-0,5 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, добавляют 2-4 мл крови специально отобранных доноров, затем пробирку на 3/4 заполняют изотоническим раствором хлорида натрия.
Перемешивают, центрифугируют и оставляют стоять до оседания эритроцитов. Отмытые стандартные эритроциты хранят в холодильнике. Срок годности - 2-3 дня. Ампулы со стандартными сыворотками двух различных серий каждой группы ставят в 2 штатива. Отдельно ставят сыворотку группы АВ0 (IV). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в отдельный штатив с тремя гнездами в порядке: группа 0 (I), А (II) и В (III). На пластинке делают надписи слева направо: 0 α-b , А b и В α для стандартных сывороток и 0, А и В - для стандартных эритроцитов. Под соответствующими обозначениями наносят по 1 большой капле всех стандартных сывороток и по 1 маленькой капле стандартных эритроцитов. Исследуемую кровь для отделения сыворотки центрифугируют или оставляют стоять 20-30 мин. Исследуемую сыворотку по 1 большой капле капают на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна эритроциты исследуемой крови и наносят их по 1 маленькой капле рядом с каждой каплей стандартной сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами сухими стеклянными палочками. Через 1 мин в те капли, в которых наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор хлорида натрия и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения 5 мин.

Возможные варианты реакций:

1) реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие агглютиногенов, т.е. на принадлежность исследуемой крови к группе 0 (I). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы 0 (I) и положительную - с эритроцитами групп А (II) и В (III);

2) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена А. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0 (I) и А (II), но положительную - с эритроцитами группы В (III);

3) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногена В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0 (I) и В (III), но положительную - с эритроцитами группы А (II);

4) реакция со стандартными сыворотками указывает на наличие в исследуемой крови агглютиногенов А и В. При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, т.е. не содержит агглютининов.

Определение резус-фактора методом конглютинации с применением желатина. Исследуемые эритроциты инкубируют со стандартной сывороткой антирезус, содержащей неполные антитела-резус, в коллоидной среде - растворе желатина. Если исследуемые эритроциты резус-положительны, происходит их склеивание - конглютинация, которая обнаруживается после добавления в инкубационную смесь изотонического раствора хлорида натрия. Резус-отрицательные эритроциты не склеиваются.

Для реакции используют: стандартные сыворотки антирезус с неполными антителами двух различных серий (группа стандартной сыворотки должна быть совместима с группой исследуемой крови), 10%-ный раствор желатина в ампулах заводского изготовления, 0,85%-ный раствор хлорида натрия, 3,8%-ный раствор цитрата натрия, стандартные эритроциты для контроля.

В одну пробирку вносят 0,05 мл исследуемых эритроцитов. В другую пробирку помещают 0,05 мл стандартных резус-положительных эритроцитов группы 0 (I) или группы, одноименной с исследуемой кровью. В третью пробирку - по 0,05 мл стандартных резус-отрицательных эритроцитов той же группы, что и исследуемая кровь. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл 10%-ного раствора желатина, предварительно подогретого до 48 °С. Слегка встряхивают для перемешивания. После этого в первую пробирку вводят 0,1 мл сыворотки антирезус одной серии, во вторую - по 0,1 мл сыворотки антирезус второй серии. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и все пробирки помещают в водяную баню при 48 °С на 5 мин или термостат при той же температуре на 30 мин. После прогревания приливают по 8-10 мл подогретого изотонического раствора хлорида натрия, содержимое пробирок перемешивают и затем просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.

Когда кровь резус-положительна, в пробирке наблюдаются легко различимые красные зерна или хлопья, состоящие из склеенных эритроцитов, на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне. Если эритроциты резус-отрицательны, в пробирке видна равномерно окрашенная в розовый цвет, слегка опалесцирующая жидкость.

Результаты следует считать истинными при совпадении их в обеих сериях стандартной сыворотки-антирезус. В контрольных образцах стандартные резус-положительные эритроциты одноименной группы или группы 0 (I) с сывороткой-антирезус должны дать положительный результат, а стандартные резус-отрицательные эритроциты одноименной группы - отрицательный. Кроме того, отрицательный результат должен быть также во всех пробирках третьего ряда, т.е. без сыворотки-антирезус.

Определение неполных антител

Как к изоантителам, так и к аутоантителам могут относиться тепловые антитела (оптимум действия при 37 °С), главным образом, класса IgG. Они называются неполными, унивалентными и, покрывая поверхность эритроцитов, не вызывают их агглютинацию в солевом растворе, однако могут склеивать эритроциты в среде с высокой концетрацией белка (альбумина или сыворотки). Тепловые антитела класса IgG редко обладают способностью фиксировать комплемент, вызывая лизис эритроцитов, т.е. выступать в качестве гемолизинов. Обычно эритроциты, покрытые антителами IgG, секвестрируются селезенкой, где они теряют часть оболочки, что приводит к фрагментации и сфероцитозу, или агглютинируют (в среде с высокой концентрацией белка) и захватываются макрофагами. Фиксированные на эритроцитах неполные антитела выявляются прямой пробой Кумбса (антиглобулиновой пробой). Суть метода состоит в агглютинации эритроцитов, покрытых антителами класса IgG, антисывороткой кролика против γ-глобулина человека. Непрямая проба Кумбса определяет неполные антитела, содержащиеся в сыворотке крови и могущие быть как аутоантителами, так и изоантителами. В этой пробе эритроциты донора инкубируют с исследуемой сывороткой крови, затем отмывают и соединяют с антиглобулиновой сывороткой, т.е. проводят пробу Кумбса, и с ее помощью устанавливают, имеются ли на поверхности донорских эритроцитов неполные антитела. При положительном варианте происходит агглютинация эритроцитов.

Определение ристомицин-агрегации (агглютинации) в богатой тромбоцитами исследуемой плазме отражает взаимодействие фактора Виллебранда (ФВ) с собственными тромбоцитами пациента. При исследовании in vitro ристомицин способствует связыванию ФВ с тромбоцитарным рецептором ГП1в. Процесс агрегации, индуцируемый добавлением к богатой тромбоцитами исследуемой плазме стандартного количества ристомицина, регистрируется фотометрически по падению ее оптической плотности. Измерения проводятся в агрегометре или на модифицированном фотоэлектроколориметре, снабженном перемешивающим и записывающим устройствами. Ристомицин-агрегация тромбоцитов может снижаться как при качественных, так и при количественных дефектах ФВ.

Определение активности фактора Виллебранда (ристомицин-кофакторной активности - РКА) исследуемой плазмы основано на его способности вызывать в присутствии ристомицина агглютинацию нормальных донорских тромбоцитов. В классическом методе, предложенном H.I. Weiss, предлагается использование суспензии свежеприготовленных отмытых донорских тромбоцитов для измерений, проводимых в агрегометре. При этом взвесь отмытых и ресуспендированных донорских тромбоцитов должна иметь концентрацию около 250 ґ 109 /л. В кювету агрегометра добавляют взвесь доведенной исследуемой бедной тромбоцитами плазмы и стандартизованное количество ристомицина. Последующий агрегационный процесс регистрируется в течение нескольких минут с помощью записи увеличения трансмиссии. Угол наклона полученной кривой пропорционален РКА исследуемого образца плазмы. РКА исследуемой плазмы определяется в процентах по калибровочной кривой зависимости максимального изменения трансмиссии за минуту от уровня РКА. Для ее построения используется серия разведений стандартной коммерческой или пулированной плазмы, в которых РКА соответствует 100%-, 50%-, 25%-ному уровню.

В модификациях данного метода предусмотрено использование не свежих, а фиксированных формалином донорских тромбоцитов. Такая обработка тромбоцитов способствует длительному хранению их без потери рецепторов к ФВ. Для этого из донорской крови, взятой на ЭДТА-формалиновом растворе (соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) в соотношении 9: 1, готовится бедная тромбоцитарная плазма. Полученный после ее удаления тромбоцитарный осадок дважды отмывается ЭДТА-буферным раствором и разводится в буфере до концентрации тромбоцитов 200-250 ґ 109/л. Полученный тромбоцитарный реагент может храниться.

В настоящее время коммерчески доступны тест-наборы, основанные на регистрации агглютинации лиофилизированных фиксированных тромбоцитов как методами агрегатометрии, так и слайд-тестами. Определение РКА в слайд-тестах требует меньших затрат времени и характеризуется более высокой точностью.

ПЛАН q 1. Серологические реакции, которые используются для серологической диагностики. q 2. Серологические реакции, которые используются для серологической идентификации. q 3. Современные методы Иммунологических исследований при инфекционных болезнях: (Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный анализ, генодиагностика, полимеразная цепная реакция). q 4. Серологические реакции, которые используются в вирусологии. q

РЕАКЦИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ С ДВОЯКОЙ ЦЕЛЬЮ: q для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни; q для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками антителами – для серологической идентификации возбудителей.

КЛАССИФИАЦИЯ q Иммунные реакции подразделяются на простые и сложные. Для их постановки необходимы основные два компонента: антиген и антитело. q К простым реакциям, применяемым для диагностики, относятся реакции агглютинации, реакции преципитации, реакции нейтрализации. q К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный метод, радиоиммунный метод, иммуноферментный метод, иммунолюминесцентный метод исследования, метод иммуноблотинга.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ q Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. q Реакция протекает в две фазы. q В первой фа зе происходит специфическая дсорбция а антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, q Во второй - образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

АГГЛЮТИНАТ q Агглютинат может быть двух типов мелкозернистый и крупнохлопчатый. q Мелкозернистый – это результат взаимодействия мелких бактерий, q крупнохлопчатый – бактерий, имеющих жгутики.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ТИПЫ q Все реакции агглютинации подразделяются на два типа: q ориентировочные (ОРА), которые выполняются на стекле, q развернутые (РРА) – выполняются в пробирках с титрованием сыворотки.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ НЕДОСТАТОЧНО СПЕЦИФИЧНА И ЧУВСТВИ ТЕЛЬНА. q Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. q Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. q Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. q Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции. .

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ q Ориентировочные реакции также могут иметь две цели: q Идентификация микробного вида (с использованием известной иммунной сыворотки). q Поиск антител в сыворотке крови пациента с использованием известного микробного диагностикума.

СХЕМА ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ. Этапы выполнения реакции: v На обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора. v Внести петлей исследуемую культуру бактерий, равномерно распределить в капле физиологического раствора v Добавить каплю специфической агглютинирующей иммунной сыворотки v Учесть результат реакции. v Положительной считается реакция, когда в капле происходит просветление жидкости и формирование агглютината.

ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА + + Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление жидкости. Результат положительный + + + Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над осадком слегка мутновата. Результат положительный + + Слабая агглютинация: осадок небольшой, жидкость непрозрачная. Результат слабоположительный + Следы агглютинации: осадок маленький, надосадочная жидкость непрозрачная. Сомнительный результат реакции Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ: ЭТО РЕАКЦИЯ. МИНКЕВИЧА И РЕАКЦИЯ ХЕДДЕЛЬСОНА v Реакция Минкевича позволяет определить наличие противотуляремийных антител у инфицированного пациента. v Необходимые ингредиенты: v Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора из пальца больного v Дистиллированная вода v Туляремийный диагностикум.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ МИНКЕВИЧА: v На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента v Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов v Внести каплю туляремийного диагностикума v Учесть результаты. v Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна агглютината.

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента, но и определить титр антител. Необходимые ингредиенты: v Сыворотка пациента v Физиологический раствор v Бруцеллезный диагностикум

ПРИНЦИП МЕТОДА v основан на использовании большого стекла фотопластины, v концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в нарастающих или уменьшающихся объёмах, v дополняемой до определённого уровня физиологическим раствором, что приравнивается к разным разведениям, и v окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей видимости образующегося агглютината. v Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при +37 Сº. v На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от нескольких больных. v Результат получают через 2 5 минут в виде голубого агглютината разной активности в зависимости от разведений.

РЕАКЦИЮ АДСОРБЦИИ АГГЛЮТИНИНОВ ПО КАСТЕЛЛАНИ ПРИМЕНЯЮТ ДЛЯ ДЕТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СЕРОВАРА: q Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. q При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию.

Принцип метода: v Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции v специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела - и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ - только групповые. v В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют родственные гетерологические АГ. v Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым паратифа А.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА (РАЛ) ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ(ОРИЕНТИРОВАЧНЫЙ ВАРИАНТ) q Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром 0, 5 1, 2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2 7 мин. q Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий. q Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. q Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т. д.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА). Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту Ig. G человека и кролика. Поэтому молекулы Ig. G после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА). q Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1 2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. q Смесь тщательно перемешивают и через 2 5 мин. на тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ НАИБОЛЕЕ ИЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ v Основана на способности антител взаимодействовать с антигеном, фиксированным на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. v Для постановки этой реакции необходимо приготовление эритроцитарного диагностикума. v Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов: антигенный и антительный.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ: Необходимые ингредиенты: q Сыворотка крови инфицированного пациента q В лунки планшета внести физиологический раствор в одинаковом количестве 0, 25 мл для разведения сыворотки q В первую лунку внести сыворотку крови пациента, разведенную в 50 раз в объеме 0, 25 мл; перемешать содержимое пипеткой и этой же пипеткой набрать 0, 25 мл и перенести в следующую лунку q Перемешать содержимое и повторить эту процедуру во всех лунках, предназначенных для проведения реакции. q Приготовить контроль, для чего в одну лунку внести 0, 25 мл физиологического раствора q Во все лунки, включая контрольную, внести по 2 капли приготовленного эритроцитарного диагностикума и перемешать путем осторожного покачивания планшета. q Физиологический раствор q Эритроцитарный диагностикум q Реакция пассивной гемагглютинации выполняется в лунках иммунологического планшета.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ Положительной считается проба, когда в лунках планшета на дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки» , а в опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика» . Схема постановки и учета РПГА

КРИТЕРИИ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ + + Полная агглютинация: осадок занимает все дно лунки. Результат положительный + + + Неполная агглютинация: осадок занимает три четверти дна лунки. Результат положительный + + Слабая агглютинация: осадок занимает менее половины дна лунки. Результат сомнительный + Следы агглютинации: осадок небольшой. Сомнительный результат реакции Отрицательная реакция: осадок занимает центральное положение с округлыми краями.

. РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ v Развернутые реакции агглютинации предложены для поиска антител в сыворотках крови инфицированных пациентов при некоторых бактериальных инфекциях. v При этом применяются диагностикумы, приготовленные из микроорганизмов. v Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЭТИХ РЕАКЦИЙ НЕОБХОДИМО ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ. Разведение 1: 10 это 1 мл сыворотки + 9 мл физ. раствора 1: 50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или 1: 50 это 0, 1 мл сыворотки + 4, 9 мл физ. раствора 1: 100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или 1: 100 это 0, 1 мл сыворотки +9, 9 мл физ. раствора. v В 10 пробирок вносим по 2, 5 мл физиологического раствора. 8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль сыворотки и контроль антигена. v В контроль сыворотки вносим только разведенную сыворотку в объеме 2, 5 мл, в контроль антигена только взвесь диагностикума.

УЧЕТ РЕАКЦИИ v Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси диагностикума. v В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках просветляется, на дно оседает осадок агглютината. v Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена равномерно мутная взвесь диагностикума. v Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно видно формирование осадка агглютината.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ) Ингредиенты Содержимое пробирок Контроль Сыворотки Физиологический раствор 0, 85 Антигена 0, 5 - 0, 5 в 0, 5 0, 5 % хлорида натрия, мл Сыворотка разведении 1: 50 мл Разведения Диагностикум, (1: 50) 1: 100 1 2 2 к 1: 200 1: 400 1: 800 - 2 к 2 к 2 к - 2 к млрд. микробных тел В термостат при +37 С° на 2 часа, затем на 18 20 часов при в 1 мл. комнатной температуре

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ХАРАКТЕРУ АНТИГЕНОВ: q В реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. q Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества. q Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. q За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

ФЕНОМЕН ПРЕЦИПИТАЦИИ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЕТСЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ: q В судебно медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. q Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). q Реакцию Ухтерлони используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. q Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ЭДС). q Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых обследованиях на сифилис. q В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов, антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический). Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета. Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген (контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата). q В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении 1: 10 и кардиолипиновый антиген. q После смешивания реагентов в течение 2 5 минут осторожно покачиваем планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в лунке становится прозрачной. q Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат, оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4 ++++ положительным. Схема реакции микропреципитации представлена на рис. 10.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РЕАКЦИЯ МАНЧИНИ) Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агара с раствором антигена образуют линии и полосы преципитации. q Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. q Взаимное рас положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. q Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. q Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак ты различных органов и т. д.

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ q Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. q Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. q В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1 2 часов. q Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. q Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5 7 суток в геле образуются зоны преципитации. q Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).

РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА q применяется редко, она используется для дифференциальной диагностики холерного вибриона от других холероподобных бактерий. q В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с бактериями, q что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису бактерий.

В РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА q антигеном служат эритроциты, антителом – антигемолитические антитела. q При образовании комплекса антиген антитело начинается активация комплемента, в результате чего мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода гемоглобина. q При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И СВЯЗЫВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА. q Необходимые антиген, антитело и комплемент. q Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. q Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. q В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: q против бактерий бактериолизины, спирохетолизины, эритроцитов гемолизины, против других клеток цитолизины. q Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. q Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК). q При образовании комплекса антиген антитело к нему всегда присоединяется комплемент. q Если антиген и антитело не отвечают другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. q При добавлении комплекса эритроциты барана гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. q Этот принцип и положено в основу РСК. q При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. q При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза реакция негативная.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК). Опытная система АНТИГЕН (Бактерия, клетка, вирус и т. д.) КОМПЛЕМЕНТ АНТИТЕЛО (сыворотка) Комплемент связался с комплексом антиген-антитело Индикаторная гемолитиче ская система ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА (АНТИГЕН) ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО) Комплемента нет - связался с опытной системой. Без комплемента гемолиз эритроцитов невозможен.

Критерии учета результатов реакции + + Полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная РСК. + + + Неполная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета; положительная РСК. + + Частичная задержка гемолиза, надосадочная жидкость красно розового цвета, прозрачная; слабо положительная РСК. + Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная РСК. Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная РСК.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИРЕЗУС - АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ. q Данная реакция проводится у беременных женщин, имеющих отрицательный резус фактор. q В случае, если у отца ребенка положительный резус фактор, то у плода возможен как положительный, так и отрицательный резус. q Для предотвращения резус конфликта необходимо знать, образуются ли антирезус антитела в течение беременности q и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их титра.

ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДАННОЙ РЕАКЦИИ НЕОБХОДИМЫ СЛЕДУЮЩИЕ ИНГРЕДИЕНТЫ q Исследуемая сыворотка q Эритроциты человека, несущие положительный резус фактор (стандартные эритроциты) q Комплемент. q Этапы постановки теста: q В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки q В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных эритроцитов q Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе. q В качестве положительного контроля используем сыворотку, имеющую антирезус антитела; в качестве отрицательного контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА ВЕДЕТСЯ ПО ГЕМОЛИЗУ: q В пробирке с отрицательным контролем наблюдаем осадок эритроцитов q В пробирке с положительным контролем – полный гемолиз, то есть q равномерно окрашенная в красный цвет жидкость q В исследуемых образцах при наличии антирезус антител – полный гемолиз, при их отсутствии – осадок эритроцитов.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ q Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) воз будителя и титра вируснейтрализующих антител. q Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответст вующим вирусом с последующим введением этой смеси воспри имчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. q На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором су дят о нейтрализующей активности сыворотки.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА) q q Основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА ши роко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (анти генам).

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ q Участвуют меченые антигены или антитела. q К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, q ра диоиммунный q иммуноферментный методы. q По своей чувстви тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ПО КУНСУ) МЕТОД ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКИ, q Для выявления микробных антигенов в тканях использовали меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (ва риантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов). q Метку антител производят флюорохромами(изотиоцианат флюоресцеина)

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА q включает использование коммерческих реагентов – антигенов или антител, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). q Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках фиксирован антиген или антитело. q После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды. q В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом в специфической фазе, q а не анализировать вторичные проявления взаимодействия – агглютинацию, преципитацию или гемолиз. q Метод отличает высокая чувствительность – обычно достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ (НА ПРИМЕРЕ ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ): q В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо отрицательной q Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут q Промываем лунки планшета фосфатно солевым буфером 5 раз q Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом q Промываем лунки фосфатно солевым буфером 5 раз q Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и бензидин q Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте q Проводим визуальный учет результатов и определение оптической плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА q При правильной постановке анализа в лунке, содержащей положительную контрольную сыворотку, меняется цвет он становится желтым. q В отрицательном контроле цвет прозрачный. q Учет результатов опытных образцов зависит от изменения цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в положительном контроле, значит, у данного пациента обнаружены антитела к ВИЧ.

УПРОЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИФА «БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ» СИСТЕМЫ q Для проведения анали за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед ствие образования продукта ферментативной реакции. q Преимущества: q не используются радиоактивные изотопы, q стабиль ность онъюгатов позволяет хранить их в течение к длительного времени, q измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, q результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). q ИФА очень легко под дается автоматизации.

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (РИА) q Преимущество РИА: отсутствует необ ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро цитов. q 2 варианта: q меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе цифическими антителами. q Для того чтобы происходило конку рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. q После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном q количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе мой пробе. .

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ: Основные А. §. Коротяев А. И. , Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С-П. , 2000. § Медицинская микробиология. / Под ред. В. И. Покровского. М. , 2001. § Л. Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М. , 2001 § Медицинская микробиология, вирусология /Под ред. А. А. Воробьева. М. 2004.

Вопрос № 26

(иммунологические реакции: агглютинации, преципитации, лизиса)

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината

Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.

^ Ориентировочная реакция агглютинации (РА) Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки. Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.

Реакции прямой гемагглютинации. Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов .

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др

Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках

Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.
В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.
Реакция лизиса

В основе лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплимента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации холерных и холероподобных вирионов)
^ Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с АТ-ми в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. Реакция гемолиза используется как индикаторное при постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК), для титрования комплемента и гемолитической сыворотки.
^ Реакция локального гемолиза в геле -является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток в лимфоидных органах.

Вопрос№27

(Иммунные сыворотки. Титр агглютинирующий, испытуемой сыворотки, диагностический титр. Диагностикумы, их виды)
Сы воротки имму нные, препараты из крови животных и человека, содержащие антитела против возбудителей инфекционных заболеваний или продуктов их жизнедеятельности. Применяются длясеродиагностики , серопрофилактики и серотерапии . В процессе приготовления С. и. сыворотка крови иммунизированных определёнными антигенами животных или людей (доноров) либо переболевших подвергается различной, в зависимости от типа и назначения С. и., обработке: очистке, при которой удаляются балластные вещества и выделяются активные, прежде всего глобулиновые, фракции белков; концентрации.

Введение человеку С. и. из крови животных может сопровождаться осложнениями (сывороточная болезнь , анафилактический шок). Концентрированные С. и. - гамма-глобулины (правильнее - иммуноглобулины, так как в них сохраняются различные глобулиновые фракции) из крови человека - практически не вызывают этих осложнений и медленнее выводятся из организма. В зависимости от назначения различают лечебно-профилактические и диагностические С. и. Лечебно-профилактические С. и. подразделяют на антитоксические - против ядовитых продуктов жизнедеятельности микробов (например, противостолбнячная, противодифтерийная, противогангренозная) и против последствий укуса ядовитых змей и насекомых; антибактериальные - воздействующие на микроорганизм (противосибиреязвенный гамма-глобулин) и антивирусные (например, противокоревой, антирабический, противогриппозный гамма-глобулины). Диагностические С. и. готовят, применяя различные антигены в зависимости от характера реакции, для которой они используются. Их применяют для идентификации возбудителей инфекционных болезней, а также в экспериментальных исследованиях и др.

. Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других. Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления

(через 10-21 сут). Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.
Титр диагностический

титр Ат к конкретному возбудителю болезни в с-ке крови, выявляемый у большинства лиц на определенной фазе болезни и не наблюдающийся у большинства здоровых людей. Подтверждает клинический диагноз болезни.
Диагностикумы - это взвеси убитых микробов, чаще всего в физиологическом растворе, применяемые в качестве антигенов для серологических реакций .

Преимущество диагностикумов перед живой культурой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагностикумов дает возможность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бактериями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремийными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефалитов и др.).
Диагностикумы, используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отношению к определенному виду микроба-возбудителя.
Более тонкие различия антител в изучаемой сыворотке устанавливают при помощи специфических монодиагностикумов. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н-диагностикумы из культуры брюшнотифозных бактерий 0-901 или бактерий паратифа № 2, обладающих общим О-антигеном с брюшнотифозными бактериями; Н-диагностикум представляет собой взвесь бактерий, обладающих выраженной подвижностью .

Вопрос№28

(Люминесцентная,темнопольная,фазовоконтрастная,электронная микроскопия)
Люминесцентная микроскопия - оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нем
Темнопо́льная микроскопи́я - вид оптической микроскопии , в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца. Темнопольная микроскопия хорошо подходит для получения изображений живых и неокрашенных биологических образцов, таких, как отдельные водные одноклеточные организмы.

Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов - простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток
Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашеные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные - фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы
^ Электронная микроскопия - это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1-5 Å).
Действие электронного микроскопа основано на использовании направленного потока электронов , который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы).
Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз.
Вопрос№30

(Микроскопический метод диагностики инфекционных болезней)
Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний позволяет выявить возбудителя непосредственно в материале от больного, пользуясь световым микроскопом. На основании анализа морфологических особенностей микроба можно достаточно точно определить его вид. Материалом для исследования могут быть кровь, костный мозг, мазки или смывы со слизистых оболочек полости рта и носа, моча, выделения из уретры, стул, спинномозговая жидкость, слюна, мокрота, гной из карбункулов или фурункулов и т.п

Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний позволяет выявить малярию, лейшманиоз, лямблиоз, гельминтозы и другие инфекционные заболевания

Вопрос№31

(Культуральный (бактериологический,вирусологический,микологический метод диагностики инфекционных заболеваний)
^ Микробиологическое (бактериологическое или вирусологическое) исследование Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя . В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

На втором этапе бактериологического метода исслебования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Бактериологическое исследование проводят также для контроля эффективности лечения больного, выявления реконвалесцентного бактерионосительства, источника возбудителя болезни в эпидемическом очаге, обследование лиц, принадлежащих к декретированным группам (работники пищевой промышленности, общественного питания, детских дошкольных учреждений и т.д.).

Выращивать и идентифицировать вирусы значительно тяжелее, чем бактерии. Прежде всего, это связано с тем, что вирусы размножаются только внутри живых клеток. Поэтому такие исследования проводят в специальных вирусологических лабораториях, используя вместо питательных сред культуры разных клеток: куриные эмбрионы, клетки тканей человека или животных.

Микологические исследования осуществляются реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диагностика микозов достаточно надежна. Микологические исследования проводят при диагностике кандидозов путем определения нарастания количества клеток дрожжеподобных грибов рода Candida, а также глубоких микозов.

Вопрос№32

(Серологический метод диагностики инф. Болезней)

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитела, антиген) неизвестным является сыворотка крови. Постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами (диагностикумами). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании “парных” сывороток крови больного, взятой в первые дни болезни и через разные промежутки времени от начала заболевания. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

2. Установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Для этой цели используются диагностические иммунные сыворотки, полученные от животных после вакцинации соответствующими антигенами. Это серологическая идентификация микроорганизмов.

При инфекционных заболеваниях серологические исследования для обнаружения специфических антител являются более доступным методом лабораторной диагностики, чем бактериологическое выявление возбудителя. В ряде случаев серологические исследования являются единственным методом диагностики инфекционных заболеваний.
Методы серологических реакций

Вопрос№33

(Аллергический метод диагностики инфекционных заболеваний)
Аллергический метод позволяет поставить диагноз инфекционного заболевания с помощью аллергических проб - накожных и внутрикожных. Метод выявляет повышенную чувствительность замедленного типа, возникающую в организме при многих инфекционных заболеваниях. Введение аллергена накожно или внутрикожно используют для диагностики бруцеллеза, туляремии, токсоплазмоза и других заболеваний.
Аллергологический метод диагностики инфекционных заболеваний основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии, гиперсенсибилизации) при введении в детский организм специфических аллергенов. Аллергены применяют в небольшом количестве. В основном их вводят внутрикожно или наносят на кожу, реже - на слизистую оболочку глаза. Для постановки внутрикожной пробы используют туберкулиновый или инсулиновый шприц. Тонкой иглой срезом вверх вводят 0,1 мл аллергена в кожу внутренней поверхности предплечья. Вводить препарат начинают после того, как срез иглы полностью войдет в кожу. Если манипуляция выполнена правильно, на месте введения аллергена образуется небольшой беловатый, плотный пузырек, напоминающий лимонную корку. Он исчезает через 10-15 минут. При заболевании (наличия специфической аллергии) через 24-72 часа в месте введения аллергена возникает реакция в виде инфильтрации с покраснением.

Аллергические реакции становятся положительными с 8-10-го дня заболевания. Чаще всего их применяет для диагностики туберкулеза (реакция Манту), бруцельоза (реакция Бюрне), туляремии, токсоплазмоза, орнитоза.

Вопрос №34

(Биологический метод)

биологический метод - осуществляют путем выделения возбудителя при заражении лабораторных животных, которые восприимчивы к данному заболеванию. Этот метод дорогостоящий, поэтому применяется ограниченно;

Вопрос№34

(Молекулярно-генетический метод)
Всё более востребованными становятся молекулярно-генетические методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), «BROAD-R

В настоящее время из молекулярно-генетических методов исследования наиболее широкое применение в диагностике инфекционных болезней нашла ПЦР, которая благодаря появлению доступных и удобных в использовании приборов завоевала прочное место в повседневной работе лабораторий. В основе ПЦР лежит искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.

Вопрос№36

(Характеристика возбудителя ВИЧ-инфекции. Принципы микробиологической диагностики. Препараты для специфического лечения)

Вирус иммунодефицита человека вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчивающуюся развитием синдрома приобретенного иммунного дефицита.

Возбудитель ВИЧ-инфекции - лимфотропный вирус, РНК-содержащий вирус. Вирусная частица сферической формы Оболочка состоит из двойного слоя липидов, пронизанного гликопротеинами. Липидная оболочка происходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула состоит из 2 субъединиц, находящихся на поверхности вириона и пронизывающих его липидную оболочку.

Сердцевина вируса конусовидной формы, состоит из капсидных белков, ряда матриксных белков и белков протеазы. Геном образует две нити РНК, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.

Геном вируса состоит из 3 основных структурных генов и 7 регуляторных и функциональных генов. Функциональные гены выполняют регуляторные функции и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе.

Вирус поражает в основном Т- и В-лимфоциты, некоторые клетки моноцитарного ряда (макрофаги, лейкоциты), клетки нервной системы.Чувствителен к физическим и химическим факторам, гибнет при нагревании. Вирус может длительно сохраняться в высушенном состоянии, в высохшей крови.

Клиника: поражается дыхательная система (пневмония, бронхиты); ЦНС (абсцессы, менингиты); ЖКТ (диареи), возникают злокачественные новообразования (опухоли внутренних органов).

ВИЧ-инфекция протекает в несколько стадий: 1) инкубационный период, составляющий в среднем 2-4 недели; 2) стадия первичных проявлений, характеризующаяся вначале острой лихорадкой, диареей; завершается стадия бессимптомной фазой и персистенцией вируса, восстановлением самочувствия, однако в крови определяются ВИЧ-антитела, 3) стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной системы. Завешается ВИЧ-инфекция последней, 4-й терминальной стадией- СПИДом.

Вирусологические и серологические исследования включают методы определения антигенов и антител ВИЧ. Для этого используют ИФА, ИБ и ПЦР. ВИЧ-антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ.

Лечение:

применение ингибиторов обратной транскриптазы, действующих в активированных клетках. Препараты являются производные тимидина - азидотимидин и фосфазид.

Терапия ВИЧ-инфицированных лиц подразумевает постоянный контроль иммунного статуса организма, профилактику и лечение возникающих вторичных инфекций, контроль над развитием новообразований. Зачастую ВИЧ-инфицируемым лицам требуется психологическая помощь и социальная адаптация.

Вопрос№37

(Характеристика возбудителей вирусных гепатитов В,С,дельта. Принципы микробиологической диагностики, препараты для лечения гепатита В)
Вирус гепатита В - семейство Hepadnaviridae Морфология: ДНК-содержаший вирус сферической формы. Состоит из сердцевины, состоящей из 180 белковых частиц, составляющих сердцевинный НВс-антиген и липидсодержащей оболочки, содержащей поверхностный HBs-антиген. Внутри сердцевины находятся ДНК, фермент ДНК-полимераза, обладающая ревертазной активностью, и концевой белок НВе-антиген.Резистентность . Высокая к факторам окружающей среды и дезинфицирующим веществам. Вирус устойчив к длительному воздействию кислой среды, УФ-излучению, действию спирта, фенола.

Развитие инфекционного процесса при попадании в кровь. Заражение происходит при парентеральных манипуляциях (инъекциях, хирургических вмешательствах), переливании крови.Патогенез и клиника заболевания. Инкубационный период 3-6 месяцев. Инфекционный процесс наступает после проникновения вируса в кровь. ВГВ из крови эндоцитозом проникает в гепатоцит. После проникновения вируса происходит достраивание плюс-нити ДНК ДНК-полимеразой до полноценной структуры. Клиническая картина характеризуется симптомами поражения печени, в большинстве случаев сопровождается развитием желтухи.Иммунитет. Гуморальный иммунитет, представленный антителами к HBs-антигену, защищает гепатоциты от вируса, элиминируя его из крови.Клеточный иммунитет освобождает организм от инфицированных гепатоцитов благодаря цитолитической функции Т-киллеров. Переход острой формы в хроническую обеспечивается нарушением Т-клеточного иммунитета.

Микробиологическая диагностика. Используют серологический метод и ПЦР. Методами ИФА и РНГА в крови определяют маркеры гепатита В: антигены и антитела. ПЦР определяют наличие вирусной ДНК в крови и биоптатах печени. Для острого гепатита характерно обнаружение HBs антигена, НВе антигена и анти-HBc-IgMантитела.

Лечение. Использование интерферона, интерфероногенов: виферона, амиксина, ингибитора ДНК-полимеразы, препарата аденинрибоно-зида.

Профилактика. Существует вакцины первого поколения полученные из плазмы крови хронических носителей.Исключение попадания вируса при парентеральных манипуляциях и переливаниях крови (применением одноразовых шприцев, проверкой на гепатит В по наличию HBs-антигена в крови доноров крови).

Вирус гепатита D - дефектный вирус, не имеющий собственной оболочки. Вирион имеет сферическую форму, который состоит из однонитчатой РНК и сердцевинного HDc-антигена. Для репродукции данного вируса необходимо участие вируса-помощника,роль которого играет вирус гепатита В. Различают три генотипа вируса. Все генотипы относятся к одному серотипу.

Резервуаром BFD в природе являются носители ВГВ. Заражение BFD аналогично инфицированию ВГВ.

осуществляется серологическим методом путем определения антител к BFD методом ИФА. Профилактика: все те мероприятия, которые используют для профилактики гепатита В. Для лечения используют препараты интерферона. Вакцина против гепатита В защищает и от гепатита D.
Морфология. Сложноорганизованный РНК-содержащим вирус сферической формы. Геном представлен одной линейной «+» цепью РНК, обладает большой вариабельностью.

Антигенная структура. Вирус обладает сложной антигенной структурой. Антигенами являются: 1. Гликопротеины оболочки 2. Сердцевинный антиген НСс-антиген 3. Неструктурные белки.

Резистентность. Чувствителен УФ-лучам, нагреванию до 50С.

Эпидемиология. Наиболее часто ВГС передается при переливаниях крови, трансплацентарно, половым путем.

Клиника: Часто встречаются безжелтушные формы, течение инфекции в острой форме, в 50 % случаев процесс переходит в хроническое течение с развитием цирроза и первичного рака печени.

Микробиологическая диагностика: Используются ПЦР и серологическое исследование.

Вопрос№38

(Характеристика возбудителей полиомиелита. Принциы микробиологической диагностики. Препараты для спец. Профилактики и лечения)

Структура. По структуре полиовирусы - типичные представители рода Enterovirus. РНК-содержащие вирусы.
Морфология : мелкие, просто организованные вирусы, сферической формы, состоят из одноцепочечной РНК и капсида.

^ Антигенные свойства: Различают 3 серотипа внутри вида: 1, 2, 3, не вызывающие перекрестного иммунитета. Все серотипы патогенныдлчеловека.
Патогенез и клиника. Естественная восприимчивость человека к вирусам полиомиелита высокая. Входными воротами служат слизистые оболочки верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта. Первичная репродукция вирусов происходит в лимфатических узлах глоточного кольца и тонкой кишки. Из лимфатической системы вирусы проникают в кровь, а затем в ЦНС, где избирательно поражают клетки передних рогов спинного мозга (двигательные нейроны). Инкубационный период продолжается в среднем 7-14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную (без параличей), абортивную (легкая форма). Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле.

Иммунитет. После перенесенной болезни остается пожизненный иммунитет. Иммунитет определяется наличием вируснейтрализующих антител, среди которых важная роль принадлежит местным секреторным антителам слизистой оболочки глотки и кишечника (местный иммунитет). Пассивный естественный иммунитет сохраняется в течение 3-5 недель послерожденияребенка.

^ Микробиологическая диагностика . Материал для исследования - кал, отделяемое носоглотки, при летальных исходах - кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы.
Вирусы полиомиелита выделяют путем заражения исследуемым материалом первичных и перевиваемых культур клеток. О репродукции вирусов судят по цитопатическому действию. Идентифицируют выделенный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации в культуре клеток. Важное значение имеет внутривидовая дифференциация вирусов, которая позволяет отличить патогенные штаммы от вакцинных штаммов, выделяющихся от людей, иммунизированных живой полиомиелитной вакциной. Различия между штаммами выявляют с помощью ИФА, реакции нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток со штаммоспецифической иммунной сывороткой, а также вПЦР.
Серодиагностика основана на использовании парных сывороток больных с применением эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов IgG, IgA, IgM определяют методом радиальной иммунодиффузиипоМанчини.
Лечение . Патогенетическое. Применение гомологичного иммуноглобулина для предупреждения развития паралитических форм ограничено.
Все больные с подозрением на полиомиелит подлежат срочной госпитализации. Лечение проводят в условиях боксированного отделения инфекционного стационара в течении 3-4 недель. Основными критериями перехода болезни в восстановительный период являются исчезновение симптомов интоксикации, болевых признаков, нормализация ликвора (спинно-мозговой жидкости)

Профилактика . Основной мерой профилактики полиомиелита является иммунизация. Первая инактивированная вакцина для профилактики – создавала общий гуморальный иммунитет, не формировала местной резистентности слизистых оболочек ЖКТ, не обеспечивала надежную защиту.

Пероральная живая культуральная вакцина из трех серотипов штаммов. Используют для массовой иммунизации детей, она создает стойкий общий и местный иммунитет.

7. Эндоцитозные, сигнальные и растворимые рецепторы врожденного иммунитета.

8. Секреторные рецепторы врожденного иммунитета.

9. Система комплемента

10. Роль белков теплового шока и острой фазы.

11. Характеристика антимикробных пептидов и их продуцентов.

12. Интерфероны, природа. Способы получения и применения.

13. Роль и. И. Мечникова в формировании учения об иммуните­те. Неспецифические факторы защиты организма.

14. Клеточные факторы врожденного иммунитета (макрофаги, нейтрофилы, естесственные киллеры, дендритные клетки, тучные клетки, базофилы, nk и др.).

15. Фагоцитоз (стадии фагоцитоза, кислородный взрыв и др.)

16. Функции естественных киллеров.

17. Мембранные и цитозольные рецепторы врожденного иммунитета (tlr, nlr, rig). См. Ответ 7.

18. Классификация и характеристика дендритных клеток.

21. Антигены микробов и клеток человека (cd, mhc). Гаптены

22. Характеристика Th1, Th2, Th17 и Treg-лимфоцитов.

23. Иммунокомпетентные клетки; t- и в-лимфоциты, антигенпрезентирующие клетки.

25. Презентация антигена. Кооперация, основные принципы дифференцировки т- и в-лимфоцитов.

26. Формы иммуного ответа. Регуляция иммунного ответа.

27)Теории иммунитета. Генетика формирования т и в-клеточных рецепторов.

28) Иммунологическая толерантность,механизмы

29)Клеточный иммунный ответ (цитотоксический и воспалительный иммунный ответ, роль цитокинов, т-хелперов и макрофагов)

30)Гуморальный иммунный ответ (роль цитокинов, Th-2лимфоцитов и в-лимфоцитов).

31) Антитела. Классы, структура и функции иммуноглобулинов.

32) Антигенные свойства иммуноглобулинов, изотипы, аллотипы, идиотипы. Полные и неполные антитела.

33) Моноклональные антитела.Получение(гибридомная технология) и применение.

34) Генетика антителообразования.

35) Иммунологическая память. Первичный и вторичный ответ.

36) Мех-мы противоинфекционного (противобактериального и противовирусного) иммунитета

37) Мех-мы противогельминтного, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета.

38)Гиперчувствительность немедленного типа. Мех-мы возникновения,клиническая значимость.

39) Анафилактический шок и сывороточная болезнь. Причины возникновения.Механизм.Их предупреждение.Аллергоспецифическая иммунотерапия.

40. Механизм гиперчувствительности замедленного типа. Клинико-диагностическое значение

44. Оценка иммунного статуса: основные показатели и методы их определения.

45. Механизмы развития аутоиммуных реакций.

46. Практическое использование серологических реакций.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

50. Реакция пассивной гемагглютинации. Компоненты. Применение.

51. Реакция коагглютинации. Механизм, компоненты. Применение.

53. Реакция преципитации

54. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

55. Реакция связывания комплемента

56. Реакция нейтрализации

57. Реакция иммунофлюоресценции (риф,методКунса)

58. Иммуноферментный метод или анализ

59. Иммунная электронная микроскопия

60. Проточная цитометрия

61. Серологические реакции, используемые для диагнос­тики вирусных инфекций.

62. Диагностикумы. Получение, применение.

63. Моноклональные антитела. Получение, применение.

64 Методы приготовления и применения агглютинирую­щих, адсорбированных сывороток.

65 Вакцины

4.2.5.1. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины

46. Практическое использование серологических реакций.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы).

Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro меж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:

1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;

2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:

Оптимального соотношения АГ и АТ;

Степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);

Концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

В настоящее время широкое применение получили ИР, в которых участвуют меченые АГ и АТ (р. иммунофлюорес-ценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы).

48. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение .

Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

49. Реакция Кумбса - антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Тест Кумбса используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов.

Суть данного метода заключается в том, что антиглобулиновая сыворотка, содержащая антитела к иммуноглобулинам человека, при реакции с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами, приводит к их агглютинации.

В зависимости от того, фиксированы ли антитела на поверхности эритроцитов или находятся в свободном состоянии в плазме крови, применяется прямая или непрямая проба Кумбса.

Прямая проба Кумбса ставится в тех случаях, когда есть основания предполагать, что исследуемые красные кровяные клетки уже in vivo подверглись сенсибилизации соответствующими антителами, т.е. первая фаза реакции - фиксация антител на поверхности эритроцитов - произошла в организме и последующее добавление антиглобулиновой сыворотки вызывает агглютинацию сенсибилизированных клеток.

С помощью непрямой пробы Кумбса выявляют неполные антитела, присутствующие в исследуемой сыворотке. В данном случае реакция протекает в два этапа. Первый этап - инкубация тест-эритроцитов с исследуемой сывороткой, во время которой происходит фиксация на эритроцитарной поверхности антител, содержащихся в исследуемом образце сыворотки. Второй этап - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция Кумбса прямая (прямой антиглобулиновый тест)

Материал для исследования: кровь из локтевой вены.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме реакция Кумбса отрицательна

Метод исследования: гельфильтрации

Прямая проба Кумбса применяется для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов. Если на поверхности эритроцитов фиксированы антитела или компоненты комплемента, добавление антиглобулиновой или антикомплементарной сыворотки вызывает агглютинацию эритроцитов.

Положительная прямая реакция Кумбса подразумевает, что in vivo эритроциты покрыты иммуноглобулинами или комплементом. Полиспецифические и анти-IgG реагенты позволяют выявить примерно 500 молекул IgG на эритроците, но имеются сведения, что при аутоиммунной гемолитической анемии эритроциты покрыты меньшим количеством иммуноглобулинов.

Положительно при :

аутоиммунном гемолизе;

гемолитической болезни новорожденных;

лекарственной иммунной гемолитической анемии;

гемолитических трансфузионных реакциях.

Реакция Кумбса непрямая

Материал для исследования - кровь из локтевой вены. сывовротка должна быть быстро отделена от крови.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме: отрицательно.

Метод: гельфильтрации

Непрямая реакция Кумбса позволяет обнаружить антитела к эритроцитам в сыворотке. Демонстрирует присутствие в плазме пациента неожидаемых антител к АВО- и резуссовместимым эритроцитам. Агглютинация показывает, что сыворотка содержит антитела к антигенам, имеющимся на поверхности реагентных эритроцитов.

Непрямую реакцию применяют в следующих случаях:

для определения индивидуальной совместимости крови донора и реципиента;

для выявления аллоантител, включая антитела, вызывающие гемолитические трансфузионные реакции;

для определения поверхностных эритроцитарных антигенов в медицинской генетике и судебной медицине;

для подтверждения однояйцовости близнецов при трансплантации костного мозга.

Положительно при:

присутствии аллоантител;

присутствии аутоантител.